酵母菌遗传.ppt

4．酵母着丝粒载体(YCp) 低拷贝，稳定 YAC(yeast artificial chromosome)是人工构建的具有酵母染色体功能的人工染色体载体。 1983年Murray等人将酵母的着丝粒、自主复制序列及一些标记基因与四膜虫大核 rDNA末端的端粒连接在一起，共同构成了长度为55kb的酵母人工染色体。 1987年，美国华盛顿大学的Burke等人构建了能克隆大片段的酵母人工染色体，这是真正意义上的第一代 YAC载体系统。 5．酵母的人工染色体(YAC) TEL ori/Amp Trp1 ARS1 CEN4 BamHI BamHI SmaI His3 TEL ori/Amp Trp1 ARS1 CEN4 Sup4 URA3 TEL BamHI SmaI URA3 TEL SmaI 原生质体和电转化 URA3/trp ade2-1赭石突变株红色菌落插入失活 BamHI 酵母的表达载体包括酵母菌的强启动子、多克隆位点、终止子。外源结构基因插入多克隆位点的适当酶切位点，在强启动子的调节下，外源基因就可进行高效表达。 酵母的启动子至少含有3个成分：上游激活序列(UAS)、TATA序列和起始密码子。 二、酵母菌的表达载体(YXp) 分泌载体是一种将基因产物分泌到胞外的一类载体。 酵母菌的分泌载体除必须含有表达载体的启动子和终止子外，还需要在表达载体的起始密码子(ATG)的上游有分泌信号序列。 三、酵母菌的分泌载体(YSp) 第五节 酵母基因表达的调控 真核生物调控的特征: 1. 真核生物基因表达的调控核心途径： 环境信号转导 染色质活化 转录的激活 2. 基因表达以正调控为主（激活蛋白激活靶基因） 3. 转录与翻译在不同的亚细胞区域进行 转录水平的调控 顺式作用元件: 影响自身基因表达活性的非编码DNA序列,包括启动子、增强子、沉默子。 反式作用因子： 为DNA结合蛋白，核内蛋白，可使邻近基因开放（正调控）或关闭（负调控）。包括通用转录因子和特异性转录因子。 上游激活序列（upstream activating sequence UAS） TATA元件 转录起始位点 沉默子 一、酵母基因的启动元件（顺式作用元件） 通用转录因子 结合在TATA序列附近，包括TFII-A、TFII-B、TGII-D、TFII-E、TFII-F等。 转录调控因子 结合在启动子上游 转录调控蛋白由两个独立的结构域组成： DNA结合区 转录激活区 二、转录调控因子（反式作用蛋白） 通用转录因子 结合在TATA序列附近，包括TFII-A、TFII-B、TGII-D、TFII-E、TFII-F等。 转录调控因子 结合在启动子上游 转录调控蛋白由两个独立的结构域组成： DNA结合区 转录激活区 二、转录调控因子（反式作用蛋白） 研究蛋白质间的相互作用的方法: 第六节 酵母双杂交系统 蛋白质亲和层析（protein affinity chromatography） 亲和印记（affinity blotting） 免疫共沉淀（immunoprecipitation） 交联（cross linking）（Phizicky，1995） 噬菌体展示（phage display） 酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system） 一、酵母双杂交系统的作用原理 ori 2u ori TRP1 f1ori NcoI SmaI BamHI SalI pASII Amp P(ADH) DBD NLS Term CAT ATG GCC ATG GAG GCC CCG GGG ATC CGT CGA C CYH2 将DBD克隆一个酵母表达载体上，构建成pASII质粒，称为诱饵质粒（Bait plasmid） P(ADH) AD NSL Term Amp 2u ori LUE2 pActII NcoI SmaI BamHI EcoRI XhoI CAT ATG GCC ATG GAG GCC CCG GGG ATC CGA ATT CGA ori 将AD克隆到另一个酵母表达载体上，构建成和 pActII质粒, 称为目标质粒（Pray plasmid） UAS PGal4 LacZ UAS PGal4 His3 on on P1 P2 P1