青藏高原有机牦牛背最长肌肌肉的差异蛋白质组学.doc

青藏高原有机牦牛背最长肌肌肉的差异蛋白质组学 　　摘 要：以青藏高原有机牦牛为研究对象，采用超声波破碎法提取生鲜和冷藏有机牦牛背最长肌肌肉蛋白， Bradford法进行蛋白质定量后，进行双向电泳，通过PD Quest凝胶图像分析软件筛选3 倍或3 倍以上的差异斑点进行基质辅助激光解析串联飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight to time of fight，MALDI-TOF-TOF），并用Mascot软件鉴定差异蛋白，以建立青藏高原有机牦牛生鲜肉和冷藏肉背最长肌差异蛋白质组学研究方法。结果表明：经双向电泳图谱分析所获得的青藏高原有机牦牛生鲜肉和冷鲜肉背最长肌肌肉蛋白斑点数分别为1 840±181和2 034±86，分布于pH 3.0～10.0之间，PD Quest软件筛选青藏高原有机牦牛生鲜肉和冷藏肉背最长肌差异3 倍或3 倍以上蛋白质斑点36 个，其中生鲜肉相比冷藏肉有机牦牛背最长肌肌肉蛋白上调的有12 个点，下调的有24 个点，质谱鉴定有意义的差异蛋白质点7 个（蛋白质得分65）（P0.05），其中2 种蛋白质表达量上调，5 种蛋白质表达量下调。 　　关键词：有机牦牛；背最长肌；冷藏肉；生鲜肉；蛋白质组学 　　肉类产品食用品质的大幅下降引发了人们对现代肉品品质及其评价标准的深入思考，寻找一种科学的肉品品质评价方法并对其品质进行控制已成为国内外研究的热点。肉品品质的形成机理与肉质性状高度相关，而几乎所有的肉质性状都受到复杂的基因和蛋白质调控。已有的研究主要集中在对猪肉等肉质进行感官、理化特性和组织学特性的评价，尚未见到应用差异蛋白质组学方法对青藏高原有机牦牛宰后生鲜肉及冷藏肉品质的形成机理、评价和控制进行研究的报道。 　　本研究以同一饲养环境和屠宰条件，宰后以不同贮藏温度（4、18 ℃）、不同贮藏时间（0、24 h）的生鲜和冷藏有机牦牛肉作为研究对象，以差异蛋白质组学技术为研究平台，筛选与分析生鲜和冷藏的有机牦牛背最长肌肌肉的差异蛋白质，为进一步探讨有机牦牛肌肉加工过程蛋白质的降解规律提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　青藏高原有机牦牛背最长肌肌肉组织取自青海省河南县有机牦牛背最长肌（第七根胸椎到最后一根胸椎），保存备用。 　　2D裂解液、蛋白质定量试剂盒、IPG缓冲液 美国Bio-Rad公司；尿素、硫脲、3-[（3-胆酰胺丙基）-二乙胺]-1-丙磺酸（3-（3-cholamidopropyl）dimethylammoniopropanesulfonic acid，CHAPS）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、Tris-HCl、甘油、碘乙酰胺、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、甘氨酸 美国Sigma公司； 　　其余试剂为国产分析纯。 　　1.2 仪器与设备 　　双向凝胶电泳系统、固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）干胶条、Image Master 2D Platinum凝胶成像系统 美国GE公司；PD Quest软件 美国 　　Bio-Rad公司；5800基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight to time of fight，MALDI-TOF-TOF） 美国AB SCIEX公司。 　　1.3 方法 　　1.3.1 样品制备 　　生鲜（宰后18 ℃、0 h）和冷藏（宰后4 ℃、24 h）有机牦牛背最长肌肌肉样品每份取约0.5 g，加入1 mL 2D裂解液，匀浆（4 m/s、匀浆15 s、停顿2 min），匀浆间隙放于冰上冷却，重复操作3 次[1]。再对匀浆液进行冰浴超声破碎（100 W、超声10 s、间歇15 s），重复操作10 次，13 400 r/min条件下离心15 min，取上清液。 　　1.3.2 蛋白质定量 　　采用Bradford法进行蛋白质定量，于-80 ℃保存备用。 　　1.3.3 双向电泳 　　取总蛋白提取物100 μg，上样量为450 μL，pH 3～10非线性IPG胶条17 cm进行等电聚焦电泳，条件为：30 V、12h，500 V、1 h，1 000 V、1 h，8 000 V、8 h，500 V、4 h。等电聚焦结束后采用12.5%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS）胶进行垂直电泳，条件为：15 mA/胶、30 min，30 mA/胶至溴酚蓝离胶下沿0.5