DB21T 2631-2016 真鲷虹彩病毒LAMP 检测方法.docx
ICS67.120.30B50
DB21
辽宁省地方标准
DB21/T2631—2016
真鲷虹彩病毒LAMP检测方法
Loop-mediatedisothermalamplificationdetectionmethodforRedseabreamiridoviralvirus
2016-05-09发布2016-07-09实施
辽宁省质量技术监督局发布
I
DB21/T2631—2016
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。
本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。
本标准主要起草单位：辽宁出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：肇慧君，胡强，刘钊，张达古拉，栾慎顺，张雪。
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DB21/T2631—2016
真鲷虹彩病毒LAMP检测方法
1范围
本标准规定了真鲷虹彩病毒(Redseabreamiridoviralvirus，RSIV）的环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）检测方法。
本标准适用于RSIV病原的流行病学调查、诊断、检疫和监测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样
SN/T2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范
3符号代号和缩略语
下列缩略语适用于本文件。
LAMP：环介导恒温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification）Betaine：甜菜碱
Bst酶：BstDNA聚合酶（大片段）[BstDNApolymerase(largefragment)]dNTP：脱氧核糖苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）
4试剂、仪器和耗材
4.1试剂
4.1.1引物
选取特异性的RSIVDPO基因序列，设计出能专一性鉴别真鲷虹彩病毒的特异性引物组，该引物组由如下四条引物组成：
外引物1（F3）：5′-AGATGCACTGCTCAAACTCG-3′外引物2（B3）：5′-CTGATTGAGAAAGCCGCTCA-3′
内引物1（FIP）：5′-CCGCGCATCACTCGATGAACTGCGCTCAAAGAAGGCCGAC-3′内引物2（BIP）：5′-CGTGGCCCAGCTGTATGTAGC-TCTCCTCAAGACGGTGGTG-3′
4.1.2商品化DNALAMP法扩增试剂盒。
其中：BstDNApolymerase：8U/μL，-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。
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DB21/T2631—2016
2×反应缓冲液（RM）：含40mMTris-HCL（pH8.8）、20mM氯化钾溶液、20mM硫酸铵溶液、16mM硫酸镁溶液、0.2%Tween-20、1.6Mbetaine（甜菜碱）、2.8mMdNTPs每种。
4.1.3荧光目视染料。
4.2仪器与耗材
4.2.1Loopamp浊度仪：日本荣研化学株式会，型号LA-320C。
4.2.2组织研磨器。
4.2.3普通冰箱和超低温冰箱。
4.2.4反应管：由朗报loopamp提供。
4.2.5移液器：量程0.5μL～10μL，量程10μL～100μL，量程100μL～1000μL。
4.2.6吸头，配套移液器待用。
5生物安全要求
采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守SN/T2123-2008的有关规定。
6操作步骤
6.1样本的采集与处理
6.1.1采样
按GB/T18088的标准采集样品。体长小于4cm的鱼苗取整条鱼，体长大于4cm的鱼取脾和肾。
6.1.2样品处理
从病鱼的脾和肾组织采集的样品，按照重量体积1:10的比例，加入0.01mol/LPBS缓冲液(pH7.2)，用组织研磨器制备组织匀浆，备用。
6.2RSIV的LAMP检测
6.2.1核酸提取
DNA核酸提取可使用市售商品化的DNA抽提试剂盒对组织匀浆液进行抽提。
6.2.2LAMP反应体系
LAMP扩增反应采用脱氧核糖核酸扩增试剂盒（LAM