荧光定量PCR技术培训-康为详细分析.ppt

案例分析– 扩增曲线 扩增曲线很早扬起 -- 样本浓度太高 （稀释样品浓度） 案例分析– 熔解曲线 熔解曲线出现双峰 引物峰： -- 阴性对照 （体系污染，配合扩增曲线） -- 降低引物浓度 -- 重新设计引物 非特异性扩增 -- 基因组污染 -- 非特异片段 （重新设计引物） 案例分析– 熔解曲线 非正常熔解曲线 -- 试剂污染 -- 仪器需要校正 各点之间线性关系 各孔的重复性 R2相关系数 Slope ~ E 反应效率 案例分析– 标准曲线 案例分析– 标准曲线 标准曲线的线性关系不佳 -- 加样存在误差 -- 样品稀释不准确 使得标准曲线不呈梯度。 扩增效率低 （引物的扩增效率、引物与模板的最适比例） -- 调节引物终浓度 案例分析– 标准曲线 * * * * * * * * * * * * * * * * 绝对定量的步骤 拷贝数计算 对标准品进行梯度浓度稀释 荧光定量PCR反应 建立标准品 未知样品Ct代入标准曲线 确定拷贝数 质粒提取 OD值测定 计算样本浓度 /样本分子量 /样本拷贝数 标准品进行5-6个 梯度稀释 标准品稀释倍数为10 绝对定量举例 Ct值 拷贝数 Ct值 拷贝数 相对定量 参照样本 Calibrator 用于比较结果的基准。 * 相对定量 特点 选择内参基因 内参基因 beta-actin、 GAPDH、 18S rRNA等 看家基因 housekeeping gene 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小 -- 文献检索 -- 实验筛选 内参基因 -- 同样体积或重量的样本所来源的细胞数目不同。 -- RNA抽提、反转效率不同，操作中存在误差。 对样本初始浓度差异进行均一化校正。 2-ΔΔ Ct法 Company name 成立条件：假设扩增效率为100% 满足条件：1）内参基因和目标基因的扩增效率接近 2）内参基因和目标基因的扩增效率均为90%-110% 假设条件： 内参基因和目标基因扩增效率差异大于5% 1）优化实验条件，使扩增效率接近 2）使用其他方法 相对定量方法 2-ΔΔ Ct法 相对定量举例 相对定量分析 待测样品目的基因 浓度 待测样品内参基因 浓度 F 对照样品目的基因 浓度 对照样品内参基因 浓度 假设条件： 内参基因和目标基因扩增效率不同 优点：实验优化简单 缺点：每一轮实验都必需做标准曲线 双标准曲线法 80% 相对定量举例 双标准曲线法 实 验 流 程 Company name SYBR Green法实验流程 Company name 样本处理 RNA提取 qPCR 数据分析 逆转录 样本处理与RNA提取 外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照 逆转录 逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？ RT-PCR一步法还是两步法？ 两步法: 反转录和PCR扩增分两步进行。 步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检测 多个基因。便于反应优化。在工作的初期。 一步法：反转录和PCR扩增在同一管内完成。 简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。在工作的成熟阶段。 总原则与普通PCR相同： 避免引物二聚体，避免二级结构 扩增片段长度（80 - 300bp 推荐做跨intron设计 引物设计原则 Master mix的应用 使用Master mix有效降低系统误差 -- 热启动酶 Hotstar 化学修饰，低温下酶活抑制性强，热复活需10min Fast Hotstar 抗体修饰，热复活仅需几十秒 -- Buffer 反应增强剂 减少模板二级结构影响 控制Mg2+浓度 稳定剂 -- Dye Real SYBRGreen mix RealSuper mix Master mix的优化 新型荧光染料 Super Green 激发、发射波长与SYBR Green近似 对PCR反应抑制更轻微 可使用较高浓度 1uM, SYBR green 0.3uM 更亮，灵敏度更高 对小片段DNA和ssDNA结合更弱 减少背景，有效信号更强 化学性质更稳定 致突变性与毒性更弱 SYBR Green Super Green Master Mix ROX Passive Reference 不参与、不干扰PCR反应 恒定发射荧光信号 用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。 有不同