离子交换层析幻灯片.ppt

离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组份离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。 flash 固定相 离子交换剂：基质（载体），电荷基团（功能基团），反离子（交换离子） 阴离子交换剂：反离子为阴离子， OH- 阳离子交换剂：反离子为阳离子， H+ 流动相：缓冲溶液 与反离子交换 分离原理：带电荷的不同，吸附强度不同 洗脱原理：高离子强度解吸附，改变pH 在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。 各种离子与离子交换剂上的电荷基团的结合是由静电力产生的，是一个动态平衡的过程。结合的强度与离子交换剂的性质、离子本身的性质、离子强度、pH、温度、溶剂组成等有关。 蛋白质等生物大分子与离子交换剂的结合和它们的性质及pH有较大关系。 两性电解质 等电点(pI): 缓冲液pHpI时，蛋白质带正电 缓冲液pHpI时，蛋白质带负电 ■ 离 子 交 换 反 应 种 类 + Net Charge of a Protein Buffer pH pI - 0 阴离子交换 阳离子交换 ■ 离子取代优先顺序 Pecking Order： ++ + + + + 电荷高者 离子大者 浓度大者 Juang RH (2004) ECX 离子交换剂的电荷基团（功能基团） 阳离子交换剂的电荷基团带负电，可交换阳离子物质。根据电荷基团的解离度不同，可分为强酸型、中等酸型和弱酸型三类。区别在于电荷基团完全解离的pH范围，强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离，而弱酸型完全解离的pH范围则较小。 结合磺酸基团（-SO3H），如磺酸甲基（简写为SM）、磺酸乙基（SE）等为强酸型离子交换剂，结合磷酸基团（-PO3H2）和亚磷酸基团（-PO2H）为中等酸型离子交换剂，结合酚羟基（-OH ）或羧基（-COOH），如羧甲基（CM）为弱酸型离子交换剂。 阴离子交换剂的电荷基团带正电，可交换阴离子物质。根据电荷基团的解离度不同，可分为强碱型、中等碱型和弱碱型三类。 结合季胺基团（-N(CH3)3），如季胺乙基（QAE）为强碱型离子交换剂，结合叔胺（-N(CH3)2）、仲胺（-NHCH3）、伯胺（-NH2）等为中等或弱碱型离子交换剂，如结合二乙基氨基乙基（DEAE）为弱碱型离子交换剂。 交换容量 交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量，反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。 通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换剂所能提供交换离子的总量，又称为总交换容量，它只和离子交换剂本身的性质有关。 在实际实验中关心的是层析柱与样品中各个待分离组份进行交换时的交换容量，它不仅与所用的离子交换剂有关，还与实验条件有很大的关系，一般又称为有效交换容量。一般交换容量如未经说明都是指有效交换容量。 ■ 不同胶体的吸附容量有很大差异： Lactalbumin Albumin Ferritin Buffer: 0.01 M Tris-HCl, pH 8.0 mg / mL gel Adapted from Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.64 影响交换容量的因素很多，主要可分为两个方面。 一方面是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组份的大小等的影响。这些因素主要影响离子交换剂中能与样品组份进行作用的有效表面积。样品组份与离子交换剂作用的表面积越大当然交换容量越高。一般离子交换剂的孔隙应尽量能够让样品组份进入，这样样品组份与离子交换剂作用面积大。 小分子样品，可以选择较小孔隙的交换剂，小分子可以自由进入孔隙，而小孔隙离子交换剂的表面积大于大孔隙的离子交换剂。 较大分子样品，可以选择小颗粒交换剂，很大的分子，一般不能进入孔隙内部，交换只限于颗粒表面，而小颗粒的离子交换剂表面积大。 另一些影响因素如实验中的离子强度、pH值等主要影响样品中组份和离子交换剂的带电性质。 pH对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大，如对于弱酸型离子交换剂在pH较高时，电荷基团充分解离，交换容量大，而在较低的pH时，电荷基团不易解离，交换容量小。 pH影响样品组份的带电性。对于蛋白质等两性物质，在离子交换层析中要选择合适的pH以使样品组份能充分地与离子交换剂交换、结合。 一般来说，离子强度增大，交换容量下降。实验中增大离子强度进行洗脱，就是要降低交换容量以