离子交换层析 (2).ppt

*****海南大学农学院wss*第63页,共85页，星期六，2024年，5月*海南大学农学院wss*离子强度的线性梯度洗脱曲线p86盐浓度吸收曲线第64页,共85页，星期六，2024年，5月*海南大学农学院wss*离子强度非线性梯度(阶梯式洗脱曲线)第65页,共85页，星期六，2024年，5月*海南大学农学院wss*影响梯度洗脱速率变化的因素A：当CA、CB的浓度确定后，总体积V越小，梯度速率变化越快。ABB：当体积V确定时，CB－CA差值越大，梯度速率变化越快。0.50.40.30.20.10.50.40.30.20.1Vt1Vt2第66页,共85页，星期六，2024年，5月*海南大学农学院wss*比较线性梯度与阶梯式梯度洗脱显示：在样品组分、柱子规格、缓冲液成份、洗脱速度相似的条件时，其分辨率有差异。但并未表现明显优势。依据实验经验，当分离物各组分差异较小时，选用线性梯度；差异较大则选用阶梯式梯度，以减小体积和节省时间。第67页,共85页，星期六，2024年，5月*海南大学农学院wss*A.C.相同条件的线性梯度

A.流速8毫升/小时，C为20毫升/小时；

B与A的流速相同，离子梯度不同

结果：三者显示分辨率不同的结果线性梯度、洗脱速度与分辨率第68页,共85页，星期六，2024年，5月*海南大学农学院wss*梯度图的分析当缓冲液的pH﹥pI（样品）时，样品带负电荷，结合到阴离子交换剂，解吸附时，将pH下降，越来越靠近pI，直至其pI、甚至pH﹤pI,样品电荷由－0＋。样品解离。A为阴离子交换剂。pH从10－7.5，变化。当缓冲液的pH﹤pI（样品）时，样品带正电荷，结合到阳离子交换剂，解吸附时，将pH上升，越来越靠近pI，直至其pI、甚至pH﹥pI,样品电荷由＋0－。样品解离。B为阳离子交换剂。pH从4.5－8.9变化。AB第69页,共85页，星期六，2024年，5月*海南大学农学院wss*内容提要第一节 基本原理第二节 离子交换剂的分类与性质第三节操作第四节应用第70页,共85页，星期六，2024年，5月*海南大学农学院wss*去离子水的制备自来水过滤R-SO3H柱RN(CH3)3OH柱去离子水混合柱RN(CH3)3OH柱1.水处理第71页,共85页，星期六，2024年，5月*海南大学农学院wss*交换柱的填充树脂一般采用强酸型阳离子交换树脂和强碱型阴离子交换树脂，如001×7(732#)和201×7(717#)；由于交换容量不同，实验中通常采用一根阳离子交换柱和二根阴离子交换柱。混合柱也应按等交换容量比例混合；混合柱的作用：由于离子交换是可逆反应，经过阳离子交换柱和阴离子交换柱处理的去离子水，还存在着微量未交换的离子。若让它再通过混合柱，由于两种交换过程同时进行，离子交换后生成的H+和OH?结合成水而除去，进一步提高了水的质量。实验室精制去离子水可采用?5cm×100cm混合柱处理一次去离子水。第72页,共85页，星期六，2024年，5月*海南大学农学院wss*2.分离纯化小分子物质离子交换层析广泛应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化。第73页,共85页，星期六，2024年，5月*海南大学农学院wss*核苷酸的解离性质（pK）核苷酸磷酸基一级解离氨基磷酸基二级解离pIAMP0.93.76.22.35GMP0.72.46.11.55CMP0.84.56.32.66UMP1.0__6.4__见图P88的分离图谱第74页,共85页，星期六，2024年，5月*海南大学农学院wss*3.分离纯化生物大分子物质离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。用离子交换层析制备、纯化电荷量不同的生命物质时，不但被分离物的活性可以保存，而且分辨率较高。第75页,共85页，星期六，2024年，5月*海南大学农学院wss*各蛋白质样品的等电点BSApI=4.7糜蛋白酶pI=8.8胰蛋白酶pI=8.1细胞色素CpI=9.8～10.1第76页,共85页，星期六，2024年，5月*海南大学农学院wss*4.测定蛋白质的等电点pH活力单位5678