基因工程和蛋白质工程.ppt

****************************************************************以噬菌体或病毒为载体，将所需基因或含有此基因的DNA片段转移给受体细胞的过程，称为转导。我们常常采用?噬菌体作为基因工程的载体，其一它的遗传结构与功能知道得比较清楚；其二是易于使细胞感染，易于使外源DNA导入宿主细胞。2.噬菌体——感染细菌的病毒第31页,共53页，2024年2月25日，星期天以?噬菌体为载体进行DNA克隆

?DNA用限制性内切酶除去中间一段与外源DNA连接重组载体的体外包装带有外源DNA的?噬菌体太小不能被包装头部前体多联体DNAA蛋白COSCOSCOS成熟的颗粒在宿主细胞内进行DNA的装配过程第32页,共53页，2024年2月25日，星期天三、重组DNA的筛选及表达1.转化——带有目的基因的载体进入受体细胞2.筛选——从大量受体细胞选出带有重组体的细胞3.表达——外源DNA在受体细胞的转录和翻译第33页,共53页，2024年2月25日，星期天1.转化——带有目的基因的载体进入受体细胞由质粒作载体形成的克隆，转入细菌时细菌预先要在低温条件下用氯化钙处理，形成“感受态”细胞。即增加细胞膜的通透性才能实现转化。由噬菌体作载体的克隆，转入细胞的过程称为“侵染”。因噬菌体具有自动侵入的功能。细菌不用预先处理。第34页,共53页，2024年2月25日，星期天?噬菌体感染大肠杆菌的途径

第35页,共53页，2024年2月25日，星期天第36页,共53页，2024年2月25日，星期天2.筛选——从大量受体细胞选出带有重组体的细胞（1）插入失活法（2）放射性探针检测法（3）R-环检测法（4）免疫测定法第37页,共53页，2024年2月25日，星期天（1）插入失活法在现在的基因工程操作中，所使用的载体通常是经过加工改造的衍生物，它们要么带有一个或几个可供选择的遗传标记，要么具有被选择的遗传功能，这就使带有目的基因与不带目的基因的细菌有明显区别，便于筛选。第38页,共53页，2024年2月25日，星期天pBR322质粒结构

如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入，四环素抗性基因失活第39页,共53页，2024年2月25日，星期天（2）放射性探针检测法利用mRNA可与相应的DNA段落杂交，来检测有外源DNA插入的重组体，是一种快速而灵敏的方法。第40页,共53页，2024年2月25日，星期天第41页,共53页，2024年2月25日，星期天（3）R-环检测法在有利于形成R-环的条件下，使待检测的纯化的质粒DNA，在含有mRNA的缓冲液中局部变性。如若质粒DNA存在着与mRNA探针互补的序列，mRNA就会取代DNA中一条链，与另一条链形成双链杂交分子，从而形成R-环结构，在电子显微镜下观察，可直接观察到R-环。这样可检出重组体质粒DNA。第42页,共53页，2024年2月25日，星期天（4）免疫测定法免疫法测定只能是所转移外源DNA必须表达后才能进行，而且必须具备有效的特异性抗体。第43页,共53页，2024年2月25日，星期天第44页,共53页，2024年2月25日，星期天Southern和Western印迹法DNAfrangmentElectrophoresisTransferofDNAbyblotting32P-labledDNAprobeAutoradiographyAgarrosegelAutoradiogramNitrocellulosesheetAutoradiogramPolymersheetSDS-PolyacrylamidegelTransferproteinAddradiolabledspesficantibody,WashtoremoveunboudantibodyProteinbanddetectedbyspecificantibodyAutoradiography第45页,共53页，2024年2月25日，星期天3.表达——外源DNA在受体细胞中的转录和翻译带有目的基因的载体转移到受体细胞成功并筛选出来后，最终目的是要目的基因在受体细胞中得以表达，产生具有功能性的蛋白质或肽。第46页,共53页，2024年2月2