食品级地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的分离纯化.doc

成绩 大学考试题 课 程 生物分离工程 学 院 考 试 日 期 年 月 日 专业班号 姓 名 学 号 期中 期末 √ 第一题：（30分）生物分离工程的一般步骤是什么？各步骤的单元操作主要有哪些？生物分离过程的选择标准是什么？通过本课程的学习，谈谈你对生物技术下游加工过程今后发展动向的理解？ 答：1)一般步骤及单元操作：1.发酵液的预处理与固-液分离，主要操作有：加热、调节PH、沉降、过滤、错流过滤、均质化研磨、溶胞、萃取；2.初步纯化，主要步骤：沉淀、吸附、萃取、超滤；3.高度纯化，主要步骤：层析、离子交换、亲和、疏水、吸附、电泳；4.成品加工，主要步骤：无菌过滤、超滤、冷冻干燥、喷雾干燥、结晶。 2) 选择标准：1.采用步骤数应最少，2.步骤的次序要相对合理，3.适应产品的技术规格，4.生产规格，5）进料组成，6.产品形成，7）产品的稳定性，8.物性，9.环保和安全要求，10.生产方式。 3)向着能耗更低，更加清洁的方向发展。生物科技应用愈加广泛，生物技术的下游加工过程也进一步的扩大，竞争也愈加激烈。成本的控制，污染的排放也就成为了竞争的重要手段。随着科学技术的发展，新的技术研究与开发显得愈发重要，靠新的技术降低成本降低污染提高产品纯度是未来生物技术下游加工过程发展的主要方向。 第二题：以制备食品级的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶为目的，选择合适的生物分离工程单元操作，合理安排单元操作的顺序，并绘制流程图。分离纯化得到的产品必须进行检测。 答： 实验原理： 1. 2709 碱性蛋白酶是我国加酶洗涤剂中的一种酶制剂，同时又能广泛应用于食品、丝绸等工业部门。我国因酶的精制技术尚未达到发达国家水平，制剂菌体含量高、颜色深、有臭味，不能满足消费者的需要。因此，2709 碱性蛋白酶的精制问题是国内生产中急待解决的课题。 食品工业中，常用提高大豆蛋白溶解性的方法主要是蛋白酶酶解，这种方法虽然能在很大程度上提高溶解性及改善某些功能性，但大豆蛋白原有的保健功能受到了不同程度破坏。而利用去酰胺方法对大豆蛋白进行改性，不仅可以提高蛋白质的溶解性、凝胶性等功能特性，而且能很好的保留其保健功能。因此，通过去酰胺改性方法制备高活性大豆蛋白有很高的应用价值。去酰胺改性方法包括物理方法、化学方法和生物酶法。物理改性虽然具有安全性好、作用时间短及对营养性质影响较小等优点，但改性效果并不十分明显，而化学改性出于安全性的考虑，多用于基础理论研究的分析。目前国内外对大豆蛋白改性研究主要集中在酶的水解改性从而提高其溶解性。因为采用蛋白酶水解的方法可以改变大豆蛋白的空间结构，有效改善蛋白的各种功能特性，且酶解过程也易于控制，具有重要的实用价值。李玉珍等利用2709 碱性蛋白酶酶解大豆分离蛋白取得了良好的效果，结果表明：通过酶解蛋白质结构发生变化，分子质量显著降低，水解产物含有大量的多肽、寡肽以及氨基酸等，提高了大豆蛋白的消化利用率。本实验拟对芽孢杆菌2709 的分离纯化及酶的基本性质进行较为深入的研究，以期为高去酰胺活性碱性蛋白酶的分离纯化及应用提供参考。 2.食品级酶：食品级酶的生产, 对宿主体系的选择是非常严格的。基因工程中最常用且研究最为广泛和深人的是大肠杆菌。但是, 由于它是食品不卫生条件的微生物指标, 食品科学家或食品级酶的生产者对它是十分厌恶的。目前在食品级酶的生产中, 原核生物一般选用枯草杆菌、地衣芽抱杆菌、乳酶链球菌、嗜热链球菌等。真核生物一般以酵母和哺乳动物细胞作宿主细胞。 食品级固体酶制剂对纯度不一定要求严格，但强调安全卫生，要严格按照国家制订标准执行，采用乙醇沉淀提取，然后制成颗粒状或粉状。 3.有机溶剂沉淀法：由于有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子表面不同电荷引力，导致溶解度降低；同时有机溶剂的亲水性大，能破坏蛋白质水化膜，故可利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中溶解度差异而分离沉淀酶(或蛋白质)，称为有机溶剂分离沉淀法。 有机溶剂沉淀蛋白质的能力随蛋白质种类及有机溶剂的种类而不同。一般有机溶剂的沉淀能力依次为丙酮异丙醇乙醇甲醇。这个顺序还受温度、pH、盐离子浓度等因素影响。丙酮分离效果最好，变性失活情况也较小，除了丙酮外，乙醇等也常用。在食品级酶制剂生产中采用乙醇较多，特别是生产食品级酶制剂 时对卫生要求有保证。 有机溶剂的用量常采用相当于酶液二倍体积的有机溶剂沉淀酶蛋白，在分段沉淀时，有机溶剂的最适浓度也应通过实验来确定。如果采用逐步提高有机溶剂，他的用量可按公式计算： 式中 V和——分别为加入的有机溶剂体积和