分子生物学常用技术WXK凝胶电泳技术杂交技术精要.ppt

分子生物学常用技术 3.1 凝胶电泳技术 3.2 分子杂交技术 3.3 PCR技术 3.4 生物芯片 3.5 基因文库构建 3.6 DNA测序 3.1 凝胶电泳技术 凝胶电泳(Gel electrophoresis)是分子克隆的中心技术之一。 1. 琼脂糖凝胶用于分离200~1000bp的片段； 操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5~500bp的片段； 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开，能容纳相对大量的DNA 用于DNA测序；核苷酸多态性的分析 3.1 凝胶电泳技术 3.1.1 琼脂糖凝胶电泳的原理 琼脂糖 Agarose 主要从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合线性多糖分子。琼脂糖溶液冷却形成的琼脂糖凝胶 Agarose gel呈网状结构，具有分子筛效用，可作为DNA电泳介质。琼脂糖凝胶的孔径取决于琼脂糖的浓度。 经化学修饰后熔点降低的琼脂糖叫低熔点琼脂糖 Low melting point agarose ，其机械强度无明显变化，但可被agarase水解。主要用于胶中DNA的直接酶促反应。 3.1.1 琼脂糖凝胶电泳的原理 核酸是带均匀负电荷的生物大分子，在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。 以适当浓度的凝胶作为电泳支持介质，其分子筛效应使得大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴定、纯化核酸片段的标准方法。 用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）对DNA 染色，在紫外光下激发红色荧光，可直接确定DNA在凝胶中的位置。 凝胶电泳原理-EB染色 核酸电泳的指示剂 核酸电泳常用的指示剂有两种： ⑴ 溴酚蓝 ⑵ 二甲苯青， 3.1.2 琼脂糖凝胶电泳的影响因素 1．核酸的性质 ——DNA分子的大小，构象 2．凝胶孔径的大小 ——凝胶浓度 3．电场强度和电场方向 ——电极，电压，电流 4．缓冲液 ——缓冲液组成和离子强度 a ．DNA分子迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋线性DNA）。 b． 琼脂糖浓度：logU=logU0 Kr? 胶浓度，U为迁移率，U0 为DNA的自由电泳迁移率，?为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA Agarose：0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb 1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb。 c． DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状线状DNA单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。 d． 所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm。 e． 碱基组成与温度：一般影响不大，4 -30 ℃。 f． 嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)。 g． 电泳缓冲液 （0.5×TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，0.5×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。 3.1.3 琼脂糖凝胶电泳的应用 琼脂糖凝胶电泳应用——PCR产物检测 琼脂糖凝胶电泳应用——酶切产物电泳检测 琼脂糖凝胶电泳应用——RFLP分析 琼脂糖凝胶电泳应用——核小体DNA分析 琼脂糖凝胶电泳应用——凋亡细胞DNA分析 琼脂糖凝胶电泳应用——凝胶阻滞分析 琼脂糖凝胶电泳应用——凝胶足迹法分析 琼脂糖凝胶电泳应用——DNA印迹电泳 琼脂糖凝胶电泳应用——正交场脉冲电泳 RNA 电 泳 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RN