人DRD1基因启动子区克隆和双荧光素酶报告基因系统的构建.doc

人DRD1基因启动子区克隆和双荧光素酶报告基因系统的构建 王春红，李 哲，王明菡，邓丽丽，王 欢(沈阳医学院公共卫生学院毒理教研室，辽宁省沈阳市 110034) 引用本文：王春红，李哲，王明菡，邓丽丽，王欢. 人DRD1基因启动子区克隆和双荧光素酶报告基因系统的构建[J].中国组织工程研究，2016，20(40):6060-6066. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.40.020ORCID: 0000-0002-5083-3962(王春红) 文章快速阅读：文题释义： 多巴胺受体：多巴胺作为一种内源性神经递质，主要通过多巴胺受体调控其功能。多巴胺受体是能与多巴胺特异性结合而发挥其调节效应的蛋白类物质。多巴胺受体为7个跨膜区域组成的G蛋白偶联受体家族，目前已分离出5种类型(DRD1-DRD5)。根据它们的生物化学、药理特性和生理功能的差别，可分为D1类和D2类受体，两类受体的C端含有磷酸化和棕榈酰化位点，涉及激动剂依赖性受体的去敏感化过程和第四胞内环的形成。 荧光素酶报告基因：是以荧光素为底物来检测萤火虫荧光素酶活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化荧光素生成氧化荧光素，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光。通过荧光测定仪也称化学发光仪测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达，是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种方法。 摘要 背景：多巴胺受体启动子区多态性位点的改变会影响受体的表达量，进而影响多巴胺能神经递质的作用，导致相关疾病的发生。 目的：通过克隆人DRD1基因的启动子区，构建含有该基因启动子序列的双荧光素酶报告基因载体并检测其活性，为研究DRD1基因的转录调控提供基础工具。 方法：以人静脉血基因组DNA为模板，通过PCR扩增DRD1基因启动子序列并克隆至pGM-T载体，测序验证无误后酶切连接至萤火虫荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic，构建含有DRD1基因启动子的荧光素酶报告基因载体，采用阳离子脂质体法与内对照质粒pGL3-TK共转染HEK293细胞同时以不含启动子的pGL3-Basic载体与内对照质粒pGL3-TK共转染作为阴性对照组，化学发光仪检测相对荧光强度。 结果与结论：①通过酶切和测序验证重组荧光素酶报告基因载体的DRD1基因启动子区序列正确；②与阴性对照组相比，该重组载体转染HEK293细胞后具有转录活性；③成功构建了含有DRD1基因启动子区的荧光素酶报告基因载体，为研究该基因的转录调控提供了基础工具。 关键词： 实验动物；基因病毒载体相关因子模型；多巴胺受体D1基因；双荧光素酶报告基因；启动子；克隆 主题词： 受体, 多巴胺；基因, 报告；转录启动子；组织工程 基金资助： 辽宁省教育厅一般项目(L) Constructing the dual luciferase reporter vector containing human DRD1 promoter region Wang Chun-hong, Li Zhe, Wang Ming-han, Deng Li-li, Wang Huan (Department of Toxicology, Public Health School of Shenyang Medical University, Shenyang 110034, Liaoning Province, China) Abstract BACKGROUND: The polymorphisms of dopamine receptor in promoter region will affect the expression of the receptor, thereby affecting the dopaminergic neurotransmitter, finally lead to related diseases. OBJECTIVE: To construct the dual luciferase reporter vector containing human DRD1 promoter region and determine its activity, which could provide the basic tool for studying the transcriptional regulation of DRD1 gene. METHODS: DRD1 promoter sequence was amplified by PCR using the human blood genomic DNA and clo