第三章 凝分离技术.ppt

二、凝胶分离操作技术 1、凝胶装柱 ①将层析柱垂直装载支架上，将下端输液管夹紧； ②向柱中加入约1/3体积的0.9％NaCl溶液（或洗脱液）； ③将一细玻棒伸入柱内，靠近管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内加入混匀的凝胶溶液； ④凝胶加至层析柱顶端约3cm时，打开柱下端输液开关，使流速控制在0.25-0.5ml/cm2·min。 ⑤连续而缓慢的加凝胶直到稳定在离管口约5cm处。 注意：防止空气进入凝胶床 装柱操作注意事项： 灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱床高度，不能时断时续，否则将出现分层或“纹路”等毛病。若出现这些现象，可以用玻璃棒将已经形成的柱床逐步搅起，直至出毛病的地方，再继续加入搅匀的凝胶悬液。若在灌好凝胶后才发现“纹路”、分层等现象时，要重新装柱，以免影响层析效果。在做大型的凝胶柱时，灌注的凝胶是否均匀往往从表面上看不出来，所以使用前应用一些带色的大分子物质如细胞色素C、血红蛋白或专用的蓝色葡聚糖—2000（Blue dextran-2000）通过凝胶柱，以检查形成的带色斑带是否整齐，若斑带歪斜，应该重新装柱，直至达到要求。 注1：刚从冰箱中取出的凝胶液，不能马上用来灌柱，应平衡至室温后再用，不然装好的凝胶柱会产生大量的气泡影响层析。 注2：在整个灌注凝胶的过程及使用中，凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液，以免进入空气。若进空气，在加入溶液时，凝胶柱中易形成气泡。 注3：装好的凝胶柱，使用时应该用相当于柱体积两倍或更多的洗脱液流过洗脱柱，以压实凝胶。 2、样品的上柱及洗脱 ①加样量的控制 　　　分析：1-2ml/100ml床体积， 　　　制备：10-30ml/100ml床体积 ②洗脱液的选择：首先洗脱液最好与浸泡凝胶时所用的溶液一致，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果；水溶性物质的洗脱用水或具有不同离子强度和pH的缓冲液，非水溶性物质的洗脱用有机溶剂（苯、丙酮等）。 葡聚糖基本上不带电荷、呈惰性，不与被分离的物质发生反应，所以分离的效果较好。然而由于是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量的活性羟基，能吸附少量蛋白质等被分离的物质。为了克服这个缺点，一般使用含有离子强度达0.08的NaCl等中性盐作洗脱液。 凝胶层析加样操作示意图 图注： 1、平衡好的层析柱。 2、沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起。 3-4、打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液， 5-7、当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1mL洗脱液冲洗管壁2次。 8-9、最后加入3—4mL洗脱液于凝胶上。 10、连接柱层析系统，自动收集记录。 凝胶分离洗脱与自动收集系统 实物图 凝胶层析中的分离行为 蓝葡聚糖（兰色）、血红蛋白（红色）、铬酸钾(黄色) 3、凝胶的回收与保存 凝胶一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02％的叠氮化钠，在下次层析前将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。 如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。 三、影响凝胶分离的因素 1、流速对蛋白质分辨率的影响 2、黏度对分辨率的影响 3、凝胶柱层析操作压 操作压的增加会影响流速（变快？变慢？），此外还可以导致凝胶胶面下降，柱床容积的改变，相应测出的Vt，Vo，Ve等也改变，造成实验结果的误差。 操作压与流速的关系 4、加样量对分辨率的影响 I .加样量少时，A、 B二种物质完全分开。 II.加样量适当时， A、B 二种物质刚刚 分开。 III.加样量太大时， A、B二种物质只能 部分分开。 （1）分析工作时，样品体积为柱床体积的1~4%； 制备分离时，样品体积为柱床体积的25~30%。 （2） 分离体积（Vsep=Ve1-Ve2） 当样品体积≥Vsep时，两个相邻组分不能完全分离。 第三章 凝胶分离技术 凝胶是一种高分子聚合物，不溶于水，但遇水溶胀，形成三维空间结构。 凝胶又称分子筛，对生物大分子物质具有筛分作用。 凝胶分离即是利用凝胶分子筛的筛分作用对物质进行分离的操作。 优点： 1、凝胶为不带电荷的惰性物质，不与溶质分子发生任何作用，因此分离条件温和，产物收率高，重现性好； 2、应用范围广，所分离物质