实验四 猪瘟的临床诊断方法与技术.ppt

三、主要器材 1. 血凝板（2人/块） 2. 猪瘟病毒阳性血清 3. 猪瘟病毒阴性血清 4. 被检血清 5. 醛化红细胞悬液 6. 稀释液 7. 移液器 8. 枪头 四、间接血凝试验操作方法 孔号 1 2 3 …… 8 9 10 11 12 稀释倍数 2× 4× 8× …… 256× 512× 阳性 对照 阴性 对照 红细胞对照 稀释液 50 50 50 …… 50 50 弃50 50 血清 50 50 50 …… 50 50 50 50 红细胞 50 50 50 …… 50 50 50 50 50 结果 ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ …… ＋ ＋ － ＋＋＋＋ － － 五、结果判定标准 1. ＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100%凝集。 2. ＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，但边缘不整齐而稍向孔底集中，即75%凝集。 3. ＋＋：红细胞形成一个环状，四周有小凝集块，即50%凝集。 4. ＋：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25%凝集。 5. －：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集。 不同程度凝集强度示意图 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 稀释倍数 2× 4× 8× 16× 32× 64× 128× 256× 512× 结果 ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋ — 血凝价的判定 以出现＋＋（50%凝集）的血清最高稀释倍数为该血清的血凝价。 六、思考题 1. 常用的猪瘟诊断方法有哪些？ 2. 间接血凝试验测定的猪瘟抗体效价对于猪瘟的预防、诊断与控制有何意义？ 实验四 猪瘟的临床诊断 与防控技术 猪瘟的间接血凝试验 一、实验目的 二、实验原理 三、主要器材 四、方法和步骤 五、结果判定与分析 六、思考题 实验目的 1. 掌握猪瘟病毒间接血凝试验的原理、操作方法和结果判定方法。 2. 了解猪瘟的常用诊断方法和技术。 间接血凝试验操作方法 孔号 1 2 3 …… 8 9 10 11 12 稀释倍数 2× 4× 8× …… 256× 512× 阳性 对照 阴性 对照 红细胞对照 稀释液 50 50 50 …… 50 50 弃50 50 血清 50 50 50 …… 50 50 50 50 红细胞 50 50 50 …… 50 50 50 50 50 结果 ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ …… ＋ ＋ － ＋＋＋＋ － － 一、猪瘟的诊断方法 流行病学调查。 临诊诊断。 病理解剖学诊断。 实验室诊断。 病理组织学诊断 病原学诊断 血清学诊断 1. 流行病学： （1）病毒来源。 （2）传播方式。 2. 临床症状： （1）母猪：流产，产出弱仔、畸胎和死胎。 （2）哺乳仔猪：神经震颤、运动障碍、抽搐等。 （3）保育猪及育肥猪：发烧，便秘腹泻交替出现，腹下、耳及四肢内侧等少毛部位出血，发绀。 3. 病理解剖学诊断： （1）脾脏：边缘梗死。 （2）淋巴结：大理石样外观。 （3）肾脏：点状出血，“麻雀卵样肾”。 （4）浆膜、黏膜、心肺、膀胱：出血。 （5）回肠末端、盲肠和结肠：钮扣状溃疡。 4. 实验室诊断： 病原学诊断方法 （1）荧光抗体检测方法。 （2） RT-PCR。 （3）荧光定量PCR。 （4）兔体交互免疫试验。 血清学诊断方法 （1）ELISA：阻断ELISA、双抗体夹心ELISA。 （2）间接血凝试验。 （3）中和试验。 荧光抗体检测方法（FA） 1. 猪瘟参考实验室推荐方法。 2. 采用冰冻切片或组织触片作免疫荧光试验。 3. 需在猪瘟弱毒疫苗免疫38天后采样，如为阳性才能判断为野毒感染。 野毒与疫苗毒鉴别RT-PCR 1. 样品采集：扁桃体、公猪精液、流产胎儿等。 2. 样品保存：-20℃。 3. 病毒总RNA的提取：病料组织研磨，反复冻融3次，离心取上清，按试验盒说明书提取RNA，避免RNA酶的污染（DEPC，无RNA酶产品）。 4. RNA反转录成cDNA。 5. cDNA的PCR扩增。 猪瘟病毒抗原检测ELISA 1. 用抗E2糖蛋白单抗建立的双夹心ELISA。 2. 检测样品： （1）组织样品：扁桃体、脾脏和肠系膜淋巴结。 （2）白细胞：抗凝血（肝素或EDTA）分离。 3. 按试验盒说明书做ELISA。 猪瘟抗体阻断ELISA 1. 酶标板系用经过免疫亲和技术纯化的重组E2糖蛋白包被。 2. 先加入待检血清，再加入辣根过氧化物酶结合的抗E2糖蛋白单抗及底物显色。 3. 颜色的OD值和血清样品中抗E2糖蛋白特异抗体的量呈负相关。 兔体交互免疫试验 1. 试验原理：强毒不引起家兔体温反应，但能使其产生免疫力，而兔化弱毒能使家兔产生定型热反应，但对已产生免疫力的家兔则不产生体温反应。 2. 试验方法： 2.1