菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定.docx

14食安（1）班 赖玉健 201430520106 孙涵治 201430520119 杨泽杰 201430520124 熊渠 201430560525 14食安（5）班 李炽斌 201430520510 PAGE  PAGE 12 菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定 14食安（1）班 杨泽杰 摘要：本文结合考马斯亮蓝G250染色法，研究了不同纯化方法，包括硫酸铵沉淀法、透析法，对菠萝蛋白酶活性的影响。实验结果表明，两种纯化方法都能有效纯化菠萝蛋白酶，但是会对菠萝蛋白酶的活性造成一定的损失。 关键词：菠萝蛋白酶 沉淀法 透析法 纯化 酶活性 前 言 菠萝蛋白酶（Bromelain，EC 3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，它广泛存在于菠萝的果实、芽、叶、茎。 菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。菠萝蛋白酶的相对分子质量大约为33 000，等电点 9.55，最适pH在7.1左右，在偏酸环境下酶活下降较快，碱性环境能延缓失活。菠萝蛋白酶的温度的最稳定范围是55℃~65℃。金属盐离子中NaCl、KCl对酶活的影响不是很大，维生素C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，EDTA能通过螯合对酶活有影响的金属离子而保护菠萝蛋白酶，有机溶剂中甲醇、乙醇、乙二醇对酶活损失较大。 在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。 在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，它能帮助迅速结痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。 1 实验材料与仪器 实验材料与试剂 1.1.1 实验材料 新鲜菠萝（3个），透析袋 1.1.2 实验试剂 （1）盐析粗提液 0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS）（配4 000mL），0.01mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS）（配4 000mL） （2）酶活力测定试剂 1％酪蛋白（进口分装）（配100mL），激活剂[含20mmo1／L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二钠)] ，10％三氯乙酸(TCA) 实验仪器和用品 实验仪器 HJ-6多头磁力搅拌器：常州国华电器有限公司 MC-H18S012多功能红外炉：广东美的生活电器制造有限公司 DS-1高速组织捣碎机：上海标本模型厂 GKC110R2可控硅恒温水浴锅：赏花锦屏仪器仪表有限公司 TD5M低速离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司 TDL-60B台式离心机：上海安亭科学仪器厂 722型可见分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司 UV5100B型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司 PL1502-S电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司 BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司 BCD-539WT冰箱：青岛海尔股份有限公司 实验用品 （1）以组为单位的用品 大试管18mm×200 mm（10支）、试管架（2个）、烧杯（50mL×1，100mL×2， 200mL×1）、滴管（2支）、玻璃棒（2支）、移液管（5mL×1，1mL×2，0.1mL×1，0.2 mL×1）、漏斗（3个）、量筒 （100mL×1）、研钵、白瓷板、纱布、滤纸、蒸馏水瓶、洗耳球、标签纸、橡皮筋。 （2）全班共用的用品 试剂瓶（1000mL×7，250mL×3，60mL×20）、烧杯（1000mL×4）、塑料烧杯（2000mL×2）、量筒 （500mL×2，1000mL×2）、广泛pH试纸、剪刀、电炉和锅、蒸馏水容器、透析袋（截留相对分子质量8 000~14 000）。 实验方法 菠萝蛋白酶的粗酶提取 称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH 7.8 PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C 3000rpm离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性[1]。 盐析 根据附录的“硫酸铵饱和度计算表”，按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量，称取固体硫酸铵于研钵中，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为30%，放置于冰水混合物（4℃）30min 后，酶蛋白沉淀析出，4°C 4000rpm离心10min，收集沉淀， 加入0.1mo1/L pH 7.8 PBS约15mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质