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水痘-带状疱疹病毒编码circRNA的鉴定与表征

摘要

在真核生物中，环状RNA(circRNA)是一种重要的转录本。该研究证明了水痘-带状疱疹病毒(VZV)感染过程中可产生病毒来源的circRNA。该研究通过联合二代与三代深度circRNA测序，绘制了高分辨率的细胞和病毒circRNA谱。接着，在VZV感染的细胞以及带状疱疹病人组织样品中，通过多种实验技术手段进一步验证VZV感染可产生大量病毒circRNA。此外，该研究发现了许多与VZV潜伏相关转录本同源的circRNA(circVLTSlytic)。为了分析这些circVLTSlytic的生物学功能，利用细菌人工染色体系统在基因组DNA水平，对circVLT进行突变。结果发现，circVLT是VZV复制的非必需分子，但circVLTsSlytic外显子5下游的突变可导致VZV对阿昔洛韦敏感性增加。该研究首次证明了VZV感染可产生具有生物学功能的病毒来源circRNA，这为带状疱疹的防治提供了新的思路。

一、主要研究背景

水痘-带状疱疹病毒(VZV)是一种人类嗜神经疱疹病毒，属于α疱疹病毒亚家族。VZV感染人类可出现两种症状：裂解性感染和潜伏再次激活感染。VZV初次感染人体的症状为躯干、头部或面部出现水泡性瘙痒皮疹，称为水痘(varicella)，常见于10岁以下儿童。初次感染后，VZV在背根神经节(DRG)和三叉神经节(TG)中终身潜伏。当机体免疫力下降时，潜伏的VZV可重新激活；大量复制并沿感觉神经纤维向所支配的皮节扩散引起水痘皮疹，称为带状疱疹。由于这个过程VZV破坏其神经元，导致神经元功能紊乱、异位放电、外周及中枢敏化，导致带状疱疹病人在出疱疹期间及疱疹愈合后出现神经痛，称为带状疱疹相关性神经痛。VZV病毒基因组大小约为124kb，传统认为其大约编码71个开放阅读框(ORFs)。在VZV激活阶段（即裂解性感染，Lyticinfection），71个ORFs均可转录大量病毒RNA。但在潜伏期间，几乎所有基因均处于静息状态，仅在ORF61附近表达VZV潜伏相关转录本(VLT)。近年来研究者发现了许多新的VZV转录物、转录物异构体和未知的剪接事件，表明VZV的基因转录结构非常复杂。

环状RNA(circRNA)是一类通过反向拼接首尾共价闭合环状结构的单链RNA分子。与mRNA相比，因circRNA具有更加稳定的优势，已成为继mRNA疫苗之后下一代治疗方法的新兴关注焦点。近年的研究发现多种人类病毒可编码病毒衍生的circRNA，例如丙型肝炎病毒和默克尔细胞多瘤病毒。然而，这些病毒circRNA的形成机制及生物学功能尚不清楚。前期该团队已率先报道了人巨细胞病毒和冠状病毒(SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV)可产生病毒来源的circRNA。该研究首次充分证明了VZV的感染过程可产生具有重要生物学功能的病毒来源circRNA。

二、研究结果

1.宿主环状RNA响应VZV感染的动态特征

对VZV感染神经母胶质瘤细胞样品进行circRNA-seq。通过两种主流的circRNA算法对细胞circRNA进行定量。两种算法在每个生物学重复平均鉴定到1.5～2.2万个细胞circRNA，但随着通过合并相同条件样品测序数据以提高测序深度，鉴定到的circRNA数量可提高1倍，且鉴定到更多的未被circBank数据库收录的细胞circRNA。对细胞circRNA进行差异分析，发现VZV感染期间，大多数细胞circRNA的产生不受影响。少数VZV相关细胞circRNAs的亲本基因与细胞生长调控、染色体分离、纺锤体、GTPase调节活性、核苷-三磷酸酶调节活性信号通路、轴突导向甲状腺激素信号通路有关。

2.VZV编码circRNA的鉴定与表征

为了绘制高分辨率的VZVcircRNA图谱，本文作者采用BGISEQ短读测序和ONT长读测序两种平台。结果表明病毒circRNA随VZV感染时间而增加，较长的circRNA表达水平较低；大部分VZVcircRNA为局部近端拼接，在ORF9和ORF61附近产生更多的circRNA。接着，分别对两种平台的数据进行circRNA全长组装。对于短读测序，CIRI-full重建了42,563个人类全长circRNA和71个全长VZVcircRNA。而长读测序CIRI-long鉴定出1,2407个人类全长circRNA和1358个全长VZVcircRNA；这体现了ONT滚环长读序列检测病毒circRNA中更高的效率和可靠性。进一步分析发现，大部分的VZV和细胞circRNA都含有多个环状外显子；VZVcircRNA平均长度比细胞短；VZVcircRNA无链偏好性。有趣的是，本文作者发现一类含有多种异构体的VZVcircRNA，且与VZV潜