免免疫胶体金技术.ppt

免疫胶体金技术Immune colloidal gold technique 胶体金标记技术的相关定义 胶体金技术的发展Development of Immune colloidal gold technique 1939-----雏形 Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观察金离子呈高电子密度。 1971------作为标记物应用于免疫组织化学研究 Faulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。 1974------实现间接免疫金染色法 Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上，实现了间接免疫金染色法 胶体金技术的种类及优点 快速免疫金渗滤法(immuogold filtration assay ,IGFA) 即穿流式(flow through)的固相膜免疫测定。 主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。 免疫胶体金技术的特点 优点： 检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果； 不需仪器设备，操作人员不需特殊训练； 试剂稳定，适用于单份测定； 无污染。 GICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室即有条件开发生产。 干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。?? 最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的GICA试剂和匹配的简便测读器Cardiac Reader，其精密度和准确性均符合定量测定要求。 Colloidal Gold Synthesis Solution color varies extensively with particle size Usually a deep red, but also dark brown/purple to light orange/yellow Colloid size can be controlled by Au:Citrate ratios Anywhere between 1nm - 100nm + Citrate is easily substituted by other more Au-philic molecules (i.e thiols) Procedure of Colloidal Gold Synthesis Synthesis and properties of different particle size TEM Images of Colloidal Au How are the antibodies coupled to the gold? SAMPLE ?GOLD CONJUGATION PROTOCOL Adjust the gold colloid to the proper pH; Determined the minimum amount of protein ; Final conjugation Purification Adjust the gold colloid to the proper pH 胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。 需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可. 蛋白 与胶体金结合的最佳pH测定 取若干1.5ml的试管，分别加入1ml胶体金 用K2CO3将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10； 去96孔培养板，按pH从高到低分别将上述胶体金分别取100ul加入孔中，重复三次； 每孔分别加入20ul浓度为10%的NaCl溶液，混合，室温下放置10min； 观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH Adjust the gold colloid to the proper pH 常用几种蛋白质标记时胶体金所用的pH值 Determined the minimum amount of protein （1）光电比色法：制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml），分