出口食品中致病菌分子分型MLST检测方法 第7部分：空肠弯曲菌（征求意见稿）.doc

GB/T 4789.3.3—×××× PAGE 6 PAGE 1 PAGE 1 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局××××-××-××实施××××- 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 ××××-××-××实施 ××××-××-××发布 出口食品中致病菌分子分型 MLST检测方法 第7部分：空肠弯曲菌 Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part 7: Campylobacter jejuni （送审稿） SN/T XXXX－XXXX 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 PAGE I 前 言 SN/T《出口食品中致病出口食品中致病菌分子分型 MLST检测方法》共分XX个部分： —第1部分：金黄色葡萄球菌； 本部分为 SN/T 的第7部分。 本部分按照GB/T 1.1-2009的要求进行编写。 请注意本文件的某些内容可能涉及的专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中国食品安全风险评估中心、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、上海交通大学 本部分主要起草人：蒋原、薛峰、陈颖、郭云昌、王娉、曾德新、封振、蒋鲁岩、吕敬章、施春雷、史贤明 PAGE 2 出口食品中空肠弯曲菌分子分型 MLST检测方法 第7部分：空肠弯曲菌 1 范围 SN/T的本部分规定了检测出口食品中空肠弯曲菌的分子分型 MLST法。 本部分适用于出口食品中空肠弯曲菌的分子分型检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 4789.9 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测空肠弯曲菌，所有培养物和废弃物应参 照GB 19489中的有关规定执行。 4 防污染措施 防止污染措施应符合GB/T 27403的规定。 5 技术概要 根据空肠弯曲菌特有的7个看家基因,设计7对PCR引物序列和7对测序引物序列（参见附录A），通过靶基因片段的PCR扩增,再进行 PCR产物的纯化和DNA序列测定，将所得到的空肠弯曲菌7个看家基因测序结果与GenBank中的已有的相关基因进行BLAST，将上下游序列整合后得到完整序列，为减小误差首尾的几个碱基不计算入序列测定结果。最后将测序结果上传至MLST网站（ HYPERLINK ）进行在线数据分析，得到的结果与MLST数据库进行比对。获得菌株所对应的等位基因图谱，确定空肠弯曲菌分离株的序列型（Sequence Type, ST），并与PubMLST数据库中菌株的资料进行比较。在确定STs的基础上应用 BURST 程序将菌株分为各个谱系组（clonal complex），构建系统遗传进化树。 5试剂和材料 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求。 5.1培养基 Bolton肉汤见附录B.1，Skirrow琼脂见附录B.2 5.2参考菌株 空肠弯曲菌Campylobacter jejuni subsp. jejuni NCTC 11168 6设备 6.1冰箱：2 ℃～8 6.2恒温培养箱：25 ℃±1 ℃, 6.3微需氧培养装置：提供微需氧条件（5% O2、10% CO2和85% N2）。 6.4均质器。 6.5电子天平：感量0.1 g 5.6无菌培养皿：直径为90 mm。 PCR仪。 6检测程序 多位点序列分子分型操作程序见图1。 菌液制备 菌液制备 提取细菌基因组DNA MLST基因选择 PCR引物和测序引物的选择 PCR引物和测序引物的选择 PCR引物和测序引物的选择 靶基因片段的PCR扩增 PCR产