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比较不同途径给胰岛素对血糖的影响 立项的依据 胰岛素自发现以来一直是治疗糖尿病的主要药物，特别是1965年中国首次人工合成胰岛素成功为胰岛素广泛应用于临床奠定了基础［1］。 然而直接将胰岛素口服给药，可使其在胃肠道被蛋白酶迅速降解，故临床常采用注射给药，但注射给药给病人带来诸多不便。 近年来，非注射给药途径的胰岛素制剂已成为国内外学者的研究热点［2］。 实验目的 本实验通过对正常家兔及糖尿病家兔不同途径给予胰岛素，比较不同途径给药时胰岛素的降血糖作用。 同时学习葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的方法。 实验原理 胰岛素是一种由两条多肽链组成的酸性蛋白质，A链含21个氨基酸残基，B链含30个氨基酸残基，A、B两链通过两个二硫键以共价相连。 胰岛素通过促进糖原的合成和储存，加速葡萄糖的氧化和酵解，并抑制糖原分解和异生而降低血糖［3］。 实验对象、器材及药品 实验对象 家兔（2.5～3kg） 实验器材 722型分光光度计、离心机、兔手术台、固定 绳、水浴箱、离心管若干、小试管若干、移液管5ml和1ml若干、注射器5ml和2ml及微量注射器若干、100ml锥形瓶、胶布、纱布等。 实验药品 1%戊巴比妥钠、胰岛素注射剂、胰岛素口腔黏膜喷雾剂（40IU/ml）、四氧嘧啶、肝素、pH7.4磷酸盐缓冲液、Na2CO3、酒石酸、CuSO4?6H2O、钼酸、钨酸钠、85%浓磷酸、浓硫酸、无水葡萄糖、生理盐水、苯甲酸。 实验方法和步骤 1.家兔四氧嘧啶糖尿病模型的建立［4］： （1）、取36只健康成年家兔，雌雄兼备，体重2.5～3kg。 （2）、糖尿病模型的制备方法参考文献［5］，取18只成年家兔，雌雄兼备，空腹24h后静脉给予150mg/kg［6］四氧嘧啶生理盐水溶液，3d后待空腹血糖浓度达到16.65mmol/L以上时，即认为生成糖尿病模型。 （3）、正常家兔与糖尿病家兔分别随机分为3组，雌雄兼备，共6组。 实验方法和步骤 具体分组：i）正常组，胰岛素注射给药；ii）四氧嘧啶糖尿病模型组，胰岛素注射给药；iii）正常组，胰岛素滴眼给药；iv）四氧嘧啶糖尿病模型组，胰岛素滴眼给药；v）正常组，胰岛素口腔黏膜喷雾给药；vi）四氧嘧啶糖尿病模型组，胰岛素口腔黏膜喷雾给药。 2. 实验前家兔禁食18～20h，取六组家兔，分别称重。以3%戊巴比妥钠1ml/kg耳缘静脉注射麻醉，麻醉后将家兔仰位固定于兔台。随时补充适量戊巴比妥钠使动物在整个实验中维持浅麻醉状态。 3. 每只家兔刺破耳缘静脉取血1ml，随后立即补充同体积肝素化的生理盐水。 实验方法和步骤 4. i）组、ii）组15min后皮下注射胰岛素0.75ml/kg，并记录注射时间。分别取0、15、30、60、120、180、240min全血1ml［7］，并补充同体积肝素化的生理盐水，取血方法同步骤3。 5. iii）组、iv）组15min后用微量注射器取胰岛素50μl滴入动物左眼，并记录注射时间。分别取0、15、30、60、120、180、240min全血1ml，并补充同体积肝素化的生理盐水，取血方法同步骤3。 6. v）组、vi）组15min后取胰岛素口腔黏膜喷雾剂0.25ml/kg经适量pH7.4磷酸盐缓冲液稀释后从舌下喷雾给药，并记录给药时间。分别取0、15、30、60、120、180、240min全血1ml，并补充同体积肝素化的生理盐水，取血方法同步骤3。 实验方法和步骤 7. 葡萄糖氧化酶法测血糖操作步骤 ［8］： （1）、血液采集后，取干燥锥形瓶一个，准确加入蒸馏水7.0ml，用移液管吸取全血0.2ml，慢慢将血液滴入水中，并用其水洗涤移液管吸头，使血液全部移入锥形瓶中，混匀。 （2）、加入1/3mol/LH3SO4 0.4ml，10%钨酸钠溶液0.4ml，充分混匀，放置5～10min。 （3）、待溶液由红色变为咖啡色后，离心7min（转速为3000r/min）。 （4）、测定方法 ：手工操作法取试管3支，取上清液按下表操作。 实验方法和步骤 表-1 家兔血糖测定（ml） 试剂 空白管 标准管 测定管 血清 —— —— 2.0 葡萄糖标准应用液 —— 2.0 —— 蒸馏水 2.0 —— —— 碱性磷酸铜 2.0 2.0 2.0 充分摇匀，置沸水浴中准确煮沸8min，取出切勿摇动，冷水中冷却 磷钼酸试剂 2.0 2.0 2.0 实验方法和步骤 （5）、混匀放置3min，将上述各管用蒸馏水3ml稀释。将各管混匀后，用空白管调“0”点，在波长620nm处比色，读取标准管及测定管吸光度。 （注：本法对葡萄糖有专一性，不受其