免疫沉淀原理与实验步骤.PDF

免疫沉淀原理及实验步骤 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理 IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的 “protein A/G特异性地结合到抗体(免疫球蛋白) 的 FC 片段的现象开 发出来的方法。目前多用protein A/G 预先结合在argarose beads 上， 使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的prorein A/G 就能达 到吸附抗原的目的。通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将 目的抗原与其它抗原分离。 免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行 实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同 时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从：蛋白 样品处理；抗体-agarose beads 孵育；抗体-agarose beads 复合物洗涤 到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键 步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 IP 实验步骤 基本实验步骤 (1)收获细胞，加入适量细胞 IP 裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上 或者4 ℃裂解30min， 12,000g 离心30 min 后取上清； (2) 取少量裂解液以备Western blot 分析，剩余裂解液将 1μg 相应的 抗体和 10-50 μl protein A/G-beads 加入到细胞裂解液，4°C 缓慢摇晃 孵育过夜； (3)免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g 速度离心 5 min，将protein A/G-beads 离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads 用 1ml 裂解缓冲液洗3 －4 次；最后加入 15μl 的2×SDS 加样缓冲液，沸水 煮10 分钟； (4)SDS, Western blotting 或进行质谱分析。 具体步骤 一、 样品处理： 免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实 验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理 的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于 天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads 孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中，除了 要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外，最为关键的是裂解液的成 份。 用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞 系裂解液。我们以常用的RIPA 裂解液为例(主要含有pH7.4 左右的离 子缓冲液，接近生理浓度下的 NaCl ，一定比例的去垢剂和甘油以及 各类蛋白酶抑制剂等)来说明其各主要成份的用途，进而帮助我们如 何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。 a ． 缓冲液：离子缓冲液常采用pH7.4 的Hepes 或者Tris-Cl 。 b ． NaCl 浓度一般习惯用 150 mM，这主要是因为150 mM 接近 生理浓度，不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的 NaCl 浓度并不是均一的，局部NaCl 的浓度可以低到50 mM ，150 mM 的 NaCl 有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最 佳的NaCl 浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。 c ． 甘油由于其粘性，可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很 好的保护作用。一般添加 10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作 用。 d ． 裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜，也同时破坏了许多细 胞器的膜，从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀 实验的去垢剂作用比较温和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还 有一部分蛋白酶来自胞质中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环 境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制剂对于 防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过 添加EDTA 抑制金属蛋白酶，通过Protease Cocktail(多种蛋白酶抑制 剂混合物)可以抑制蛋白酶。