GB/T 18637-2002牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术.pdf

GB/T 18637--2002 前 台 牛病毒性腹泻/粘膜病(bovineviraldiarrhea/mucosaldiseaseBVD/MD)是由牛病毒性腹泻病毒 (BVDV玛}起的牛的 一种以粘膜发炎、糜烂、坏死和腹泻为特征的疾病 应用微量血清中和试验检查BVD/MD抗体，具有其特殊意义，它不仅可以定性，而且还可以定量， 并从抗体量的动态变化中，可以判定病牛是以前感染过本病，还是现在正在感染过程中，从而为防治本 病提供科学依据 本标准的附录A、附录B、附录c都是标准的附录 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:中国兽药监察所、农业部动物检疫所。 本标准主要起草人:邵振华、郑志刚 中华人 民共和 国国家标准 GB/T 18637--2002 牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术 Diagnostictechniquesforbovineviraldiarrhea/mucosaldisease 范围 本标准规定了牛病毒性腹泻/粘膜病(BVD/MD)的诊断技术要求。 本标准适用于BVD/MD的流行病学调查和检疫。 2 定义 本标准采用下列定义。 细胞玻片 放置在莱顿氏(Lei沙tons)管或其他用作培养细胞的小瓶中，长有单层细胞的盖玻片。 3 BVD/MD病毒分离与鉴定 3.1 材料准备 3.1.1 阳性参照毒株为牛粘膜病病毒俄勒冈毒株(OregonC,,V)o 3.1.2 BVD/MD荧光抗体(BVD/MD-FA)、阳性血清。 3.1.3 荧光显微镜:采用蓝紫光为激发光的透射式或落射式荧光显微镜 3.1.4 犊牛(或胎牛)血清:无BVD/MD抗体和无污染。 3.1.5 细胞培养瓶扁瓶、Leightons管、0.17mm厚度的盖玻片(1.0cmX3.8cm或0.8cmx 2.4cm),0.8mm- 1.0mm厚的普通玻璃载片，带盖湿盒。 3.1.6 溶液配制:pH7.0^-7.20.01mol/1,磷酸盐缓冲液，pH9.0^-9.50.5mol/I碳酸缓冲甘油 见〔 附录A(标准的附录)〕 31.7 细胞培养液:见附录B(标准的附录)。 3.1.8 原代细胞培养物:见附录C(标准的附录)。 3.2 病毒分离 3.2.1 样品的采集 32.1.1 对于牛群、种公牛的检疫，无菌采血液或精液。 3.2.1.2 对怀疑为急性感染期或持续感染的牛，采血或鼻分泌物。 3.2.1.3 对流产、死胎，采胎儿的组织。 3.2.1.4 对怀疑为死于粘膜病的牛，可采集血块和各组织，尤其是肠道集合淋巴组织。如果肠道样品已 发生白溶，可采扁桃体或淋巴结。 3.2.2 样品处理 3.2.2.1 血液用常规方法分离血清。 3.2-2.2 凝血块:冻融数次后，取析出的上清液(加人适量的双抗即青链霉素)。 3.2.2.3 组织样品用含 1000IU/m工双抗的细胞培养液作 1:10倍的乳剂，离心取上清液 中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局2002-02-19批准 2002-05-01实施 Gr/s 18637--2002 3.2-2.4 精液冻融3次(或超声波裂解处理)，用细胞培养液作1:10倍稀释，离心取上清液 32.2.5 鼻分泌物:用含1000IU(mg)/mL双抗，)的培养液4倍稀释后，离心取上清液。 以上各样品处理后均需作无菌检验 3.2.3 样品的接种培养 3.2.3.1将10ml牛辜丸原代细胞(见附录C)接种于小扁瓶，置37C静止培养。培养到细胞形成80Y 以上单层。 3.2.3.2 取出3.2.3.1中小扁瓶，倒去培养液，接种3.2.2.1~3.2.2.5的样品，每瓶接种样品1mL. 每份样品接种3瓶。 3.2-3.3 置37(、吸附2h-3ho 3.2-3.4 吸附后，将样品倒去，加维持液[见附录B中BI，另加3%犊牛血清(3.1.4)]10m工置37C恒 温培养 32.3.5 培养6d后，将其冻融3次，收集3瓶细胞及其培养基，混合后即为样品分离细胞培养物 3.3 样品分离物的病毒