实时荧光定量PCR的简介、应用及结果分析20110312.ppt

假阴性的控制——内标 FAM:525nm HEX:555nm 目的基因 内标 内标扩增曲线图 内标：已知低含量的与模板扩增效率相似的一段DNA片段，将它加入PCR反应液中，与模板共同扩增，以反应每管真实得扩增情况如果内标和样品都未扩增出结果，则表示该管扩增无效，应重新做。 此外，在圣湘磁珠法中，内标加到提取溶液中，不仅可以监控反应体系是否有效；也可以监控整个提取过程的有效性，同时实现核酸提取过程和扩增过程的监控。 真阴性？！ 定量方法问题 1.关于内标定量：采用内标对目的基因进行定量，在待测样品中加入已知起始拷贝数（浓度约为104~105IU/ml）的内标,则PCR反应变为双重PCR,双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争,尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时,这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的,所以无法加入合适数量的已知模板作为内标，也正是这个原因,传统定量方法虽然加入内标,但仍然只是一种半定量的方法。 2.关于外标定量：将样本和标准品在两个反应体系内进行，通过不同浓度的标准品绘制标准曲线，从而对样本的起始模板进行定量。 内标定量：假设内标与目标产物的扩增无相互干扰 优点 标准品和样本的反应完全一致，误差小，定量准确。 缺点 只能一点定量，线性范围窄，对浓度接近内标靶值的样本，定量准确；对于高浓度及低浓度样本定量不准确，重复性不如外标定量。 标准品与样本的信号区分要不同的检测信号，难度大，成本高。 外标定量：假设标准品和样本的扩增效率一致 标准同批，分管处理检测。 优点 多点定量，线性范围宽，定量更准确，重复性好。 成本低，易实现。 缺点 反应情况的同步性不如内标定量。 内标定量与外标定量优劣比较 美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。 综上所述,利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确,重现性最好的定量方法,已得到全世界的公认。 内标定量与外标定量的选择 仪器校准、环境控制、人员培训等 选用理想的试剂和操作方法 试剂的稳定性好 操作步骤少，误差几率低 核酸提取效率及提取步骤的可视化 选择有ROX校正的试剂 定量准确性的保证 核酸提取方法的比较 煮沸法 一步法 PCR反应管中，加5 ul核酸释放剂，再加入5ul样本 加入40 ul PCR反应试剂 上机检测 吸打3次混匀 煮沸法操作步骤多，高温煮沸容易导致气溶胶的产生；核酸提取过程不可视，易导致核酸丢失；多次离心沉淀，核酸损失多，提取效率低。 一步法操作步骤少，常温裂解病毒，不产生气溶胶；核酸提取率100%，无核酸损失，定量准确，灵敏度高。 ROX作为参比染料，能校正枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动） Rn= Normalization = Reporter / Reference=FAM/ROX 无ROX校正 有ROX校正 ROX校正的意义 圣湘生物HBV一步法流程 动画演示 PCR反应管中加入5ul“核酸释放剂” 5ul 待测样本 40 ul 反应试剂 上机检测 灵敏度可达100IU/ml，准确，重复性好 准确定量线性范围为500IU/ml～5.0×109IU/ml 可检测HBV A、B、C、D、E、F、G、H共8个基因型。 UNG酶+dUTP防污染，控制假阳性。 设置了监控内标IC,有效避免假阴性。 设置内参比荧光ROX，定量更准确。 优异的性能特点 结果分析实例 特点： 使用0.2ml平盖透明八连管或96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直观。 ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）。 ABI 7300及7500 四、荧光定量PCR常见问题分析 1. RT-PCR没有扩增曲线 1. 程序设置错误，没有采集荧光。 2. 样本中存在抑制物。 3. 手套滑石粉掉进反应管，抑制扩增。 4. 试剂荧光本底太高。 5. 仪器增益设置有误。 1. 程序设置采集荧光步骤。 2. 将样本稀释后重检。 3. 戴无粉手套，防止滑石粉落入反应管。 4. 降低试剂探针浓度。 5. 重新设置仪器荧光增益。 可能原因 解决方法 2. 扩增曲线不光滑或很斜 1. 试剂的酶不稳定。 2. 试剂不稳定，探针降解。 3. 样本中存在抑制物。 4. 仪器运行状况不佳（电压不稳，温控不好，光源老化）。 5. PCR管与仪器不匹配。 1