实时荧光定量PCR简介结果分析及报告-周向阳.ppt

数据分析一般流程 曲线分析（Amplification Plot） 标准曲线分析（Standard Curve） 定值浓度或Ct值 数据分析一般流程 该步骤主要是对扩增曲线进行整体或单个的调整，主要包括：对数曲线与线性曲线的转换、模板或内标检测探针的选择、基线的调整、阈值的设定等几个方面。 数据分析一般流程 对数曲线与线性曲线的转换：一般情况下，我们对实验结果的分析都是在线性曲线基础上进行的，因此在实验扩增结束后，需先将对数扩增曲线转换为线性曲线，以便于后续的分析。 对数曲线与线性曲线的转换 数据分析一般流程 检测通道的选择：该步骤主要是由于多色荧光检测在PCR检测中的应用越来越广泛，比如含有内标的试剂，内标的检测通道与目的基因的检测通道不同，因此需根据需求选择不同的通道进行结果分析。 对数曲线与线性曲线的转换 数据分析一般流程 基线的调整：其作用直观反应为曲线基线形状的高低或均一性变化。通常情况下，选择自动分析，此时仪器会针对每条曲线进行优化分析，因此效果通常比较好。在基线自动分析的基础上，如果出现某些形状异常的曲线，则在其他结果分析完成后，再单独对异常曲线进行手动基线调整分析。 数据分析一般流程 手动基线设定原则：1.基线的结束点应在进入线性期的前几个循环；2.基线开始点应避开反应开始时不稳定的几个循环；3.基线应选择比较平坦的区域；4.基线设定以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。 自动基线与手动基线 数据分析一般流程 阈值设定：在基线调整后则可进行阈值设定，一般选择人工阈值设定，即通过人为的移动阈值线，到达良好分析效果的目的。阈值的高低直接关系着最后的定量结果的准确性。 阈值设定的原则：阈值线一般置于曲线的指数扩增初期，通常是曲线倾斜程度整体一致的地方。 阈值线的设定 数据分析一般流程 整体曲线的观察：分析是否存在污染（主要是试剂污染）；分析是否有因物理或其他因素造成的异常曲线情况； 阴性对照分析：观察是否存在污染； 阳性对照分析：观察是否在质控范围内； 标准品分析：观察标准品分布是否均匀，梯度是否正常，Ct值是否正常； 数据分析一般流程 该面板主要用于标准曲线参数的分析，通过对曲线各个参数的统计，可以判断实验定量的准确程度或者试剂的稳定程度。其主要包括三个参数：Slope（斜率）、Intercept（截距）和R2（线性相关性）。 标准曲线分析 数据分析一般流程 Slope（斜率）：理论值为-3.32。可以从两个方面来分析，首先是标准曲线的10倍梯度关系，如果梯度正确，斜率数值会比较接近理论值；其次是试剂的扩增效率，当梯度正确的情况下，扩增效率越高越接近理论值。 Intercept（截距）：不同公司的试剂截距有很大的不同，主要是指只有1个病毒扩增时，曲线出现的Ct值。 R2（线性相关性）：指示本次实验标准品的线性关系。 注：优质试剂的标准品每次实验的参数是比较稳定的，做质控分析后偏差应在±2SD范围内，Ct值变异系数应小于10%。 数据分析一般流程 通过上述步骤分析后，可以得到一个比较准确的定量结果或Ct值，如果在上述步骤中没有记录到异常曲线或者情况，则可以发出正确的报告，对于异常的曲线或者情况，则需单独分析，确定复检的必要性。 复检的一般情况-失控 阳性质控或阳性样本的失控 阴性质控或阴性样本的失控 失控的一般情况 阳性质控或者样本没有典型的扩增； 阳性质控Ct值或者定值偏差在±2SD之外 阳性质控或者样本扩增曲线异常，不呈典型的“S”型，如直线倾斜扩增或者折线型； 失控的一般情况 核酸提取中的随机误差：如核酸提取过程中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中产生扩增抑制物的残留、所用耗材存在PCR抑制物等； 仪器问题：如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等； 试剂问题：如Taq酶和（或）反转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等； 失控的一般情况 纯化核酸：但不能完全避免来自标本核酸提取过程中所混入的去垢剂、有机溶剂的抑制作用； 重复性实验：对临床样本进行重复双份测定，避免由于操作的随机性导致结果的误差，同时也可以监测试剂的稳定性； 稀释标本：对于含有已知抑制物的标本如强溶血，则可对标本在扩增前进行稀释，再来测定； 使用“内质控”：即内标，可以避免由于试剂、扩增仪或标本处理不当所致的假阴性，因此卫生部建议使用带有“内标”的检测试剂； 失控的一般情况 标本间的交叉污染：如在实验过程中，由于操作不当，或者样本采集不当造成的交叉污染； 产物污染：通常指扩增产物泄漏导致的气溶胶污染； 试剂污染：如在提取过程中或配制反应液时造成了试剂污染，从而使得检测结果出现污染； 失控的一般情况 对实验室进行严格的分区 使用带“滤芯”的吸头 设立“阴性”质控（与标本同时处理） 使用防“污染