5蛋白质定量.PDF

生化科技學系 酵素純化與分析 5 5 蛋白質定量 ： 請注意以下三點酵素與蛋白質定量的基本問題 ： a. 蛋白質量與酵素活性不必定成正比： 酵素是一種蛋白質，因此測定純質酵素樣本中的蛋白質量，大致可說是該酵素的含量。 但須注意酵素是具有活性的分子，蛋白質含量很高的，不見得活性就高。 b.慎選標準品： 蛋白質定量需要一已知的標準品，以求得標準曲線 ，一般採用白蛋白(albumin) 或免疫 球蛋白(immunoglobulin) ，使用不同的標準品所得到的結果，會有極大的差異。 c. 注意干擾因子： 樣本中的雜質或緩衝液都可能影響定量 ，因此檢測時濃度較高的樣本，所得結果可能會 低估 ，而稀釋倍數較大的樣本，因所含干擾物質被稀釋 ，測定值比較可靠。 5.1 Biuret 法： 銅離子在鹼性溶液中，可與蛋白質胜鏈上的 carbonyl 基結合，生成紫色複合物 ，兩個 carbonyl 與一個銅離子結合成類似雙縮脲(biuret) 複合体，因此若蛋白質濃度越濃，其呈 色就越高。然而其精確度較差(數mg) ，且受到樣本中硫酸銨及Tris 干擾，但準確度較 高且不受蛋白質的種類或成分之影響。後來由biuret 法發展出更靈敏的BCA 呈色法 ， 利用兩分子bicinchoninic acid 與結合在蛋白質上的銅離子反應 ，進一步的呈色使精確度 大大提升。 5.2 Lowry 法： 也是上述biuret 呈色法的延伸，當銅離子與胜鏈形成複合物後，可再與Folin-Ciocalteau 試劑的phosphomolybdic-phosphotungstate 作用產生藍色物質，蛋白質中的芳香族胺基酸 也會與Folin-Ciocalteau 試劑結合呈色，因此比Biuret 更靈敏(約0.1 mg) 但反應步驟較 多，也受到硫酸銨及硫醇化合物的干擾。步驟中各項試劑的混合，要特別注意均勻澈底， 否則可能有大誤差。 5.3 UV 吸光法： a. 芳香基團： 胺基酸的芳香基團在280 nm 有吸光，蛋白質胜鏈骨架上的carbonyl 基團在206 nm 附近 有吸光 ，蛋白質濃度越濃則吸光度就高。由於各種蛋白質所含芳香族胺基酸組成不一， 在280 nm 的吸光能力亦不同，可以分子消光係數(molar extinction coefficient) 表示。 b. 分子消光係數： EPA 2018 67 酵素純化與分析 5 國立臺灣大學 一般以E (1%, 280 nm) 來表示，大部分蛋白質在4~ 15 間(平均為10) 。若某蛋白質E 值 為10 ，其溶液在280 nm 吸光值為1 ，則此蛋白質的濃度為1 mg/mL 。可以下式計算︰ 吸光值 ＝ E × b × c (c 為蛋白質% 濃度，即每100 mL 所含蛋白質的克數；b 為光徑 1 cm) c. 略估蛋白質濃度： 此法只有在蛋白質純度很高時，才能精確測定，但若將普通蛋白質的E 值平均定為10 ， 則對粗抽取液的略估相當方便：在280 nm 的吸光值為1 時，濃度約為1 mg/mL 。 5.4 Coomassie Blue (dye binding) 法：Bradford Method Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBG) 在過氯酸溶液中呈紅棕色，但與蛋白質結合後則變 成藍色，呈色可測595 nm 波長的吸光。此法方便靈敏(數十 g) ，且可使用微量滴定盤 進行分析，降低試劑用量，方便大量樣本的操作。請注意電泳膠片染色所用的Coomassie Brilliant Blue 是同系列的另一