质粒DNA的转化、提取和酶切分析-论文.doc

质粒DNA的转化、提取及酶切分析 摘要：目的 构建人Bcl-2基因原核表达载体，并对其酶切鉴定。方法 将Bcl-2重组质粒转化进入经CaCl2法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选培养充分克隆，然后用碱裂解法分离提取重组质粒DNA，最后用限制性内切酶酶切重组质粒DNA，并跑电泳鉴定。结果 Bcl-2重组质粒成功转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞，成功扩增提取到重组质粒DNA，酶切鉴定出现目的条带，但电泳结果较差，条带差。总结 实验过程中要避免杂菌的污染，重组质粒DNA的提取回收非常重要，如果回收浓度过低，最后跑电泳条带会很差，或者不出现目的条带。 关键词：人Bcl-2基因；质粒转化；CaCl2法；质粒提取；碱裂解法；酶切分析 随着现代分子生物学发展，分子生物学实验技术已经渗透到了生命科学的各个领域中。DNA重组技术是现代分子生物学最基本的操作技术，而质粒是存在于细菌染色体以外的小型环状双链DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息，所以质粒是DNA重组技术中的一种理想载体。进行DNA重组，经常要进行一些细菌转化、细胞转染、PCR扩增、酶切分析和DNA重组等试验，这就需要获得大量纯化的质粒DNA分子。本研究介绍人Bcl-2重组质粒DNA的转化、分离提取和内切酶酶切鉴定。转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状。转化效率直接影响前后试验的进展和工作效率，而感受态细胞的状态是影响转化效率最直接、关键的因素之一。感受态细胞的制备使用CaCl2法，因为CaCl2法转化效率高，简便易行常用。扩增后Bcl-2重组质粒DNA的分离提取使用碱裂解法，因为碱裂解法效果良好，回收效率高且经济[1]。分离获得的重组质粒DNA经限制性内切酶EcoR I酶切，并经琼脂糖凝胶电泳检测，看是否与预计相符合。 1. 材料与方法 1.1 试剂：不含氨苄青霉素的LB液体培养基、含氨苄青霉素的LB液体培养基、100mg/ml氨苄氨基酸溶液、人Bcl-2重组质粒、大肠杆菌DH5α、75%乙醇；碱裂解法试剂溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ，氯仿、异丙醇、蒸馏水；限制性内切酶EcoR1及其缓冲液、1×TAE电泳缓冲液、SYBR Green荧光染料、DNA Maker。 1.2 仪器和器材：加样枪、枪尖、EP管、玻璃涂布器、恒温水浴箱、超净工作台、恒温摇床、恒温培养箱、电泳装置、紫外成像仪。 1.3 方法：CaCl2法、碱裂解法、DNA限制性内切酶酶切分析法。 实验中将人Bcl-2重组质粒转化DH5α扩增菌，转化后在含Amp的培养基上进行筛选，生长的菌落即是含重组质粒的工程菌。扩增重组质粒工程菌获得的质粒作为限制性核酸内切酶的酶切底物DNA，酶切完跑电泳分析。 2. 实验操作 2.1 质粒转化 2.1.1 制备新鲜感受态DH5α大肠杆菌（实验前已经制备好）。 2.1.2 DNA重组子的转化大肠杆菌DH5α，如表1操作： 表1：DNA重组子的转化大肠杆菌DH5α 无菌条件下分别加入： 实验组 阴性对照组 新鲜感受态DH5a细菌 50ul 50ul 人Bcl-2重组质粒2ng/μl 5ul — 灭菌水 — 5ul ①轻轻旋转以混合内容物，冰浴30min，42摄氏度恰恰放置90s，立即冰浴2min 1.加入不含氨苄青霉素的LB液体培养基 200ul 200ul ②摇床中37摄氏度、150r/min振摇15min，使细菌复苏并表达抗性基因。 ③每管取200μl加至含氨苄青霉素的LB琼脂平板上（平板侧面用标记笔做好标记），用玻璃涂布器涂布均匀，室温放置，使液体吸收，用封口胶封好，然后37摄氏度培养12~16h至单菌落形成。 2.2 质粒DNA分离提取 2.2.1 用接种针调琼脂平板中单菌落于盛有2ml LB液体培养基(含100μg/ml Amp)的试管中，37℃摇荡培养过夜。 2.2.2 取菌液1ml收集在1.5ml的EP管中，10000r/min离心2min，吸弃上清，将离心管倒置于一纸巾上，以使所有液体流出。 2.2.3 在沉淀中加入溶液Ⅰ 250μl，涡旋混匀，静置5min。 2.2.4 加入新鲜配置的溶液Ⅱ 250μl，颠倒5次，溶液变透明、粘稠。 2.2.5 加入溶液Ⅲ 350μl，颠倒混匀，溶液出现白色沉淀。 2.2.6 12000r/min离心2min，将上清转移至吸附柱中。 2.2.7 10000r/min离心30s，弃滤液。 2.2.8 向吸附柱中加洗脱液500μl，10000r/min 离心30s，弃滤液。 2.2.9 将吸附柱换到另一新EP管中，在吸附柱中央加buffer缓冲液20μl，10000r/min离心1min，弃吸附柱，得质粒DNA分离液。 2.3 DNA限制性内切酶酶切分析 2.3.1 在质粒DNA分离提取