《农业微生物学》实验指导.doc

PAGE PAGE 44 《农业微生物学》实验指导 （适用专业：农学、园艺、植物保护专业） 黑龙江八一农垦大学植物科技学微生物教研室 目 录 实验一 油镜的使用与细菌形态观察、染色 ……………………………………… 1 实验二 微生物细胞大小的测定和显微镜直接计数 …………………………… 17 实验三 几大类微生物形态及菌落形态观察 …………………………………… 23 实验四 培养基配制；消毒和灭菌技术…………………………………………… 25 实验五 土壤中微生物的平板菌落分离、计数与纯化…………………………… 34 实验六 菌肥中有效活菌数的测定……………………………………………… 39 附录一 实验教学常用染色液…………………………………………………… 42 附录二 实验教学常用培养基…………………………………………………… 44 实验一 油镜的使用与细菌形态观察、染色 Ⅰ 油镜的使用及细菌形态观察 一、实验目的： 学习并掌握显微镜油镜的使用技术及维护的基本知识；学会使用油镜观察细菌的基本形态。 二、实验原理 微生物学研究用的显微镜通常有低倍物镜（16mm，10′）高倍物镜（4mm，40-45′）和油镜（1.8mm，95-100′）三种。油镜常标有黑圈或红圈，它是三者中放大倍数最大的。 使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n＝1.52，与玻璃基本相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系；当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样视野的照明度就减低了（图Ⅰ-1）。 利用油镜不但能增加照明度；更主要的是能增加数值口径。因为显微镜的放大效能由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质折射率所得的乘积，可用下列公式表示： 式中 数值孔径的大小又是衡量一台显微镜分辨力强弱的依据；分辨力是指显微镜能辨别物体两点间最小距离的能力。 （式中：l=光波波长） 由上述可知若n值和α角越大则NA越大或光波波长越短，则显微镜的分辨力越大（图Ⅰ-2）。 一些物质的折射率：水（1.33）、玻璃（1.52）、空气（1.0）、香柏油（1.515）。 三、实验器材 1、仪器 显微镜； 2、材料 细菌三种形态的染色标本和培养12-18h的大肠杆菌。香柏油，二甲苯，擦镜纸,吸水纸等。 图1-3 光学显微镜的构造 1. 物镜转换器 2. 接物镜 3.游标卡尺 4.载物台 5.聚光器 6. 彩虹光阑 7.光源 8. 镜座 9. 电源开关 10. 光源滑动变阻器 11. 粗调螺旋 12. 微调螺旋 13. 镜臂14.镜筒 15.目镜 16.标本移动螺旋 四、操作步骤 1、取镜 显微镜是光学精密仪器，使用时应特别小心。从镜箱中取出时，一手握镜臂，一手托镜座，放在实验台上。在使用时要特别小心。使用前首先要熟悉显微镜的结构和性能，检查各部零件是否完全合用，镜身有无尘土，镜头是否清洁。做好必要的清洁和调整工作。显微镜构造见图Ⅰ-3 2、调节光源 （1） 将低倍物镜旋到镜筒下方，旋转粗调螺旋，使镜头和载物台距离约为0.5厘米左右。 （2） 上升聚光器，使之与载物台表面相距1毫米左右。 （3） 左眼看目镜调节反光镜镜面角度（在天然的光线下观察，一般用平面反光镜；若以灯光为光源，则一般多用凹面反光镜）。开闭光圈，调节光线强弱，直至视野内得到最均匀最适宜的照明为止。 一般染色标本油镜检查，光度宜强，可将光圈开大，聚光器上升到最高，反光镜调至最强；未染色标本，在低倍镜或高倍镜观察时，应适当地缩小光圈，下降聚光器，调节反光镜，使光度减弱，否则光线过强不易观察。 3、低倍镜观察 低倍物镜（8′或10′）视野面广，焦点深度较深，为易于发现目标确定检查位置，故应先用低倍镜观察为宜。操作步骤： （1） 先将标本玻片置于载物台上（注意标本朝上），并将标本部位处于物镜的正下方、转动粗调螺旋，上升载物台使物镜至距标本约0.5厘米处。 （2） 左眼看目镜，同时反时针方向慢慢旋转粗调节螺旋使载物台缓慢上升，至视野内出现物象后，改用细调节螺旋，上下微微转动，仔细调节焦距和照明，直至视野内获得清晰的物象，及时确定需进一步观察的部位。 （3） 移动推动器。将所要观