医学电子显微学研究方法课件.pptx

第二章医学电子显微学研究方法

第一节TEM样品制备技术

细胞是生物体结构和功能单位，细胞小结构复杂无色透明，若不借助适当的手段，难以观察，更难发现细胞内各种成份的分子组成和功能，因此研究细胞的技术决定了我们对细胞的认识。许多细胞生物学的重要进展及新概念的形成来自新技术的应用。

在实际应用中电镜图像的分辨率，不仅取决于电镜本身的分辨率,也取决于样品的结构和反差，而样品的结构和反差在很大程度上受到样品制备技术的限制。电镜的分辨率在1.24?，生物样品最佳制备仅能达到20－30?，这样远远不能发挥电镜的高分辨性能，这种差距说明许多更小的结构细节还没有被人们发现和认识。;超薄切片技术UltrathinSectionTechniques是TEM生物样品制备中最基本的常规技术。它是通过一系列化学方法把组织和细胞制备成树脂包埋块，这种包埋块应具备以下性能：

1、最大限度的保持组织和细胞在生活状态下的结构及形态，保存抗原和酶的活性。

2、切片厚度在50－100nm，具有固定的形状。

3、透光度好，耐电子束轰击。

4、在TEM下树脂不成像，经过电子染色切片具有良好的反差

超薄切片技术是1948年Pease和Barker二位英国科学家创立的，经过多年的不断发展和改进现已趋于完善。现将样品制备程序归结如下：;超薄切片制备程序

Preparetionprocectureofultrathinsection

取材细切预固定冲洗后固定

冲洗脱水浸透包埋聚合包埋块

修整半薄切片复红和次甲基蓝染色

光镜定位超薄切片电子染色TEM观察

一、取材Materail

从动植物机体上，细胞及微生物的培养物中，取得所需材料的过程叫取材。由于生物材料在离开机体或正常的生长环境后，其结构在自溶酶的作用下，容易发生死后变化。为了保持生物材料的原生活状态，取材时应遵守以下原则;1、取材的要求

⑴准确：根据研究的目的和要求，要准确的确定取材的位置⑵快速：为了保持生物材料的活体状态，取材速度要块，最好在1－2分钟之内，将所取样品放入固定液中。

⑶样品体积要小：由于固定液的渗透能力弱，四氧化锇的渗透深度为0.25mm，戊二醛的渗透深度为0.5mm。为了保证固定剂能均匀的渗入到样品内，一般要求样品体积不超过2mm3。

⑷低温取材：细胞离体后，细胞内的各种水解酶释放到组织中使构成组织的主要结构，蛋白质、核酸降解造成自溶，为了降低酶的活性，要在0-4℃低温条件下取材保存。

;;⑸防止损伤：取材前要作好准备工作，用铅笔写好标签。取材器具要锋利，动作轻巧，防止挤压造成细胞的损伤。

2、取材的方法

材料来源于，实验动物、手术样品、血液、骨组织、培养细胞和活检材料等。

⑴实验动物材料：将动物用乙醚麻醉后处死，取出所需材料切成长条状，粗细在1.0×1.0×3.0mm3放入固定液中固定30分钟，然后细切成1－2mm3的小块继续固定2小时。4℃存放。

⑵人体组织材料：包括病理活检和尸检材料，这种组织往往带有血液和组织液成份，取材时用生理盐水反复冲洗后再固定。尸检材料一般在低温下保存的组织，争取在死后3－12小时内取材，最长不超过24小时，否则造成细胞膜结构的损伤。;⑶体外培养细胞材料：对生长在培养瓶中的细胞，去掉培养液，放入适量的固定液固定3－5分钟后用刮刀刮下贴壁细胞离心，离心1500－3000转15分钟，使细胞沉淀聚团。

⑷血液材料：取外周血3－5ml，放入加有抗凝剂的试管内，1ml血加抗凝剂0.15ml，离心沉淀1500转15分钟至分层。血清－血小板－白细胞－红细胞，根据所需材料，取不同的分层液，然后加入新鲜的戊二醛离心固定。

抗凝剂的配制

柠檬酸纳2g

柠檬酸8g

葡萄糖24.5g

双蒸水加至1000ml

;⑸、骨组织材料：骨组织比较坚硬，取材时组织块尽可能小一些，放入固定液中固定后在放入脱钙剂中，根据不同部位的骨组织，采用不同的脱钙时间。一般脱钙时间为1－3周，每周更换一次脱钙剂，待骨组织能被针刺进，即为钙盐已经脱好，可以进行常规制样。

脱钙剂的配制（PH7.2)