4-第8章 分子发光分析法.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * （4）表面活性剂 表面活性剂的存在，可以保护激发单重态的荧光物质分子，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。 （5）顺磁性物质 顺磁性物质（如O2）会使激发单重态的荧光物质分子向三重态的体系间窜跃速率加大，降低荧光效率。 （6）溶液荧光的猝灭 激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用，使能量转移，荧光强度减弱甚至消失。 主要组成部件 光源：高压汞灯/氙弧灯/连续可调染料激光光源 单色器（分光系统） ： 滤光片/光栅 吸收池：石英 检测器：光电倍增管 数据处理系统： I I0 F 1 .荧光分析仪器 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 二、荧光分析仪器 §4.2 分子荧光与磷光光谱分析法 LS -55荧光/磷光/发光分光光度计 §4.2 分子荧光与磷光光谱分析法 LS -55荧光/磷光/发光分光光度计  F-2500型荧光光谱仪 F-4500型荧光光谱仪 1.直接定量法 三、荧光的常规测定方法 §4.2 分子荧光与磷光光谱分析法 2. 间接测定法—猝灭荧光法 被分析物本身不发荧光，或者因荧光量子产率太低而无法进行直接测定，便只能采用间接测定的办法。如：光衍生法、荧光猝灭法、敏化荧光法等 §4.2 分子荧光与磷光光谱分析法 四、荧光分析法的应用 基于荧光对于微环境的敏感性，荧光分析已广泛用于研究化学/生物体系的物理、化学性质及其变化情况。可以采用有机试剂以进行荧光分析的元素已近70种。 §4.2 分子荧光与磷光光谱分析法 §4.2 分子荧光与磷光光谱分析法 §4.2 分子荧光与磷光光谱分析法 *五、磷光的测定方法 *1. 低温磷光分析 由于三重态寿命较长，为减小非辐射失活过程的影响，通常应在低温条件下测量磷光。 液氮是最常用的冷却剂，因而要求所使用的溶剂在液氮温度下应具有足够的黏度并能形成明净的刚性玻璃体，且对分析物具有良好的溶解特性，在所研究的光谱区内没有很强的吸收和发射，并容易制备和提纯。 §4.2 分子荧光与磷光光谱分析法 *2. 室温磷光分析 固态基质表面室温磷光分析：分析物通过物理吸附或某种化学作用力被束缚在固体基质表面，增大了刚性，减小了碰撞失活的概率，在严格干燥试样的情况下限制了氧的猝灭作用，显示室温磷光。 胶束稳定的室温磷光分析：磷光体进入表面活性剂的胶束溶液中，微环境和定向约束力发生变化，减小内转化和碰撞能量损失等非辐射失活过程概率，明显增大三重态的稳定性，使磷光强度显著增大。 敏化室温磷光分析 §4.2 分子荧光与磷光光谱分析法 *六、磷光分析法的应用 基于磷光具有Stokes位移大的优点，室温磷光分析法已成为一种与荧光分析法相互补充的重要分析技术，在生物医学、药物分析、临床检验、农药和植物生长激素的分析以及环境中多环芳烃的检测等方面得到了日益广泛的应用。 §4.2 分子荧光与磷光光谱分析法 §4.2 分子荧光与磷光光谱分析法 §4.2 分子荧光与磷光光谱分析法 *七、磷光分析仪器 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。 测量方法： （1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。 （2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。 室温测量时，不需要杜瓦瓶。 §4.2 分子荧光与磷光光谱分析法 化学发光是由化学反应提供的能量激发物质所产生的光辐射。 化学发光分析法基于化学发光现象的分析方法。 化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。 优点：(1). 灵敏度很高。(2). 仪器设备简单，无须光源和单色器，因而也消除了散射光和杂散光的干扰；(3). 线性范围宽；(4). 分析速度快。 局限：目前可供的发光体系尚有限，发光机理有待进一步研究，方法的选择性有待进一步提高。 *4.3 化学发光分析法 1.基本原理 化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。 A +B = C + D* D* → D + h? （1）能够发光的化合物大多为芳香族化合物； （2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当; ?E=170～300 kJ/mol；位于可见光区； （3）发光持续