人疱疹病毒-6型（HHV-6）试剂盒（ELISA）.doc
人疱疹病毒-6型（HHV-6）试剂盒（ELISA）
l?本试剂盒用于体外定性检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人疱疹病毒-6型（HHV-6）。
l?有效期：6个月
l?保存条件：2-8℃
l?本试剂盒仅供科研使用，不得用于临床诊断
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实验原理
试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人疱疹病毒-6型（HHV-6）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、阴性和阳性对照、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻di洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人疱疹病毒-6型（HHV-6）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），判定阴阳性。
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样本处理及要求
1.?血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.?血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃?1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3.?组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
4.?细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
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需要而未提供的试剂和器材
1.?酶标仪（450nm）
2.?高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.?37℃恒温箱
4.?蒸馏水或去离子水
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试剂盒组成
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名称
96孔配置
48孔配置
备注
微孔酶标板
96孔
48孔
无
阴性对照
0.3mL
0.3mL
无
阳性对照
0.3mL
0.3mL
无
样本稀释液
6mL
3mL
无
检测抗体-HRP
10mL
5mL
无
20×洗涤缓冲液
25mL
15mL
按说明书进行稀释
底物A
6mL
3mL
无
底物B
6mL
3mL
无
终止液
6mL
3mL
无
封板膜
2张
2张
无
说明书
1份
1份
无
自封袋
1个
1个
无
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注意事项
1.?严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
2.?洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
3.?消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。
4.?底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。
5.?避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6.?在储存和温育时避免强光直接照射。
7.?平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。
8.?任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。
9.?不能使用过期产品。
10.?如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。
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试剂准备
试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。
20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。
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操作步骤
1.??从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.??设置阴性对照孔、阳性对照孔和样本孔，阴性、阳性对照孔各加50μL对照品；
3.??样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4.??除空白孔外，对照孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.??弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.??每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.??每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
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实验结果计算
1.阴性对照OD值：小于0.2。
2.阳性对照OD值：大于0.8。