原代肝细胞..doc

原代肝细胞分离培养与方法 肝 细胞 的 分离 和 培养 是体 外 组 合性 生 物 人工 肝 研究 的 基础 ，但 单 纯机 械 分离 法 对肝 细 胞损 伤 较 大 ， 分离 后 的肝 细 胞体 外 培养 的 难度 亦 较 大 ，方 法 复 杂 ， 成 本较 高 ??体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. ?1 非 酶 分 离 细 胞 法 1．1 直接 分离 法 ：麻醉 或处 死动 物后 ，取 出肝脏 ，剪成 小 块 ，通过机械 方法(挤压 、剪碎 、震荡 、吹打)得到 单个细 胞 ，多 与 EDTA螯 合法 、灌 注法 相结合 ，即先 用 EDTA溶液 进行 充 分 的灌流 ，再剪成组 织小 块 ，然后 用各 种 机械 的方 法 分离 得 到肝细胞 。该方法 操作 简单 、流程 短 ，不 需要 复杂 仪 器和 昂 贵 的胶原酶 。但实验操作 对细胞 的损伤 大 ，尤 其是造 成 细胞 表 面蛋 白不 可逆 的机械性损伤 ，导致 细胞 的获得率 和存活 率 较 低 。 1．2 组织块培养法 ：用麻醉剂 (乙醚 、戊 巴比妥纳等 )将 动 物 麻 醉 或直 接 断 头 处 死 ，取 出 肝 脏 ，用 缓 冲 液 充 分 洗 涤 后 ，剥 离肝被 膜 ，将 其 剪 成 1 mm。的 组 织 小 块 ，充 分 洗 涤 后 ，以 0．5 cm的间隔接种 于培养器皿 中(25 m L的培养 瓶 中可接种 3O块 )，先 加 入 少 量 的 培 养 基 ，静 置 培 养 12～ 24 h后 再 加 入 足量的培养基 。该操作过程 短 ，污染少 ，损伤 小 ，细胞成 活率 很 高而成本低 。但纯度不高 ，且 形成 典型上 皮细 胞层所 需时 间 较 长 ，在 细 胞 爬 出 后 还 需 剔 除 组 织 块 ，易 造 成 二 次 污 染 。 可能是因为成年动 物 的结缔 组织 比新 生动 物 的结缔 组 织致 密 ，肝 细 胞 难 以迁 出 ，故 此 法 多 用 于 1～ 6 d的新 生 动 物 或 动 物 胚 胎 。 离体肝脏 酶消化分离法 2．1 胰蛋 白酶 、胶 原酶 消化 法 ：麻 醉 或处 死动 物后 ，取 出 肝脏 ，用 缓冲液充分洗涤后 ，剥离肝 被膜 ，将其 剪成 1 mm。的 组织小块 ，充 分洗 涤后 ，在 37℃下 用胰 酶 或 (和)胶 原 酶 消 化 ，待消化物成蓬松 的絮 状物 后加 入 培养 基终 止 消化 ，吹 打 均匀后经 200目不 锈钢 网筛过 滤后 ，离心 、重悬 即可 获得肝 细胞 。胶原酶 只消化 细胞间质而对 肝 细胞机 械性损伤 较小 ， 也能较完整地 保存膜 蛋 白¨7]，分离效 果好 。肝 细胞产 率 高 、 损伤小 ，且保持特异性功能 的时间长 。但 胶原酶 价格 比较 昂 贵 ，成本高 。胰蛋 白酶既 消化 细胞 问质 又消 化细 胞本 身 ，操 作简单 ，价格便宜 ，但胰 酶消 化 的条 件极 难 把握 而使 该法 未 被 广 泛应 用 L8．9_。 2．2 胰蛋 白酶 、胶原 酶 消化 的组 织块 法 ：处死 小 鼠，无 菌 分离肝脏 ，置 D-Hanks液 中，冲洗肝 脏 至灰 白色 ，将 肝脏 剪 成 1 mm。的组织块 ，在 37℃下用胰 酶或(和)胶原 酶消化后 ， 加人培养基终止消化 ，自然沉降后 ，取下 层组织 块 ，再 用培 养 基洗涤数次即可将肝组织块贴壁 于培养瓶 中 ，每个培养瓶放 组 织块 30~35块 ，加少许培养基 。该法分离效果 、纯度较单 纯 的组织块法好 ，且细胞从组 织块爬 出时 间相对短 。但消化 酶的用量和时间不 易控 制 ：消化过 度 ，形 成 的絮状 组织 块 不 能分离 ；消化不充分 ，酶没有发挥其作用[10~12]。 2．3 在 体 肝 脏 酶 灌 注 法 2．3．1 Seglen灌 注法 ：即经 典 的二步 胶 原酶 灌 注法 。两 步 灌注 即经 门静 脉以无 钙缓 冲液 和胶 原酶恒 流 、恒 温灌 注 ，这 是 目前 国际上公认 的方 法。首先用 不含 Ca 的离子 螯合 剂 (EDTA等)移走肝组 织中的 Ca ，从而打破 固定 细胞 的细胞 桥粒样结构 ；再用胶原 酶进 行蛋 白分 解 消化 ，最终 使纤 维 组 织 网被消化 ，细胞间连接被解除 ，再经 反复离 心分离 ，即得 到 肝细胞悬液 。有 报道 肝灌 流的途径 除 了门静 脉外 ，还有经 胆道 、腹 主动脉 等多种 途径 。 则认 为二步灌流法分离肝 细胞 的关 键是把 握两个 Ca。 的 浓度 和 两个温度 。两个 Ca。 的浓度是指预灌 流液和灌 流液 中 Ca 的 浓 度 ，为 了