蛋白质类药物的分离纯.ppt

核糖核酸酶可逆变性 定 义：加入大量中性盐以破坏Pr的稳定因素并 使从溶液中沉淀析出的现象。 原 理：破坏Pr两个稳定因素：水化膜和电荷层。 中性盐：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。 优 点：Pr不变性，常用。 定义：带电粒子在电场力作用下向着所带电荷相 反方向泳动的现象叫电泳。 原理： ● Pr分子在溶液中可带净负电荷或净正电荷，可在电场中移动。 ● 不同Pr分子携带电荷量不同，分子大小也 不同，故在电场中泳动速度不同，可彼此分离。 A. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE） ? 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。 聚丙烯酰胺凝胶机械强度好，有弹性，透明， 化学性质稳定，对pH和温度变化小，吸附和 电渗作用小，是很好的电泳支持介质。 丙烯酰胺——单体 N，N’-甲叉双丙烯酰胺——交联剂 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳主要特点 板状电泳 B. SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳 SDS的作用原理 阴离子SDS能与蛋白质结合。 当SDS总量为蛋白量的3～10倍、且SDS单位浓度大于1mol./L时，两者的结合是定量的，每克蛋白质约结合1.4克SDS。 蛋白质分子结合SDS后，所带负电荷的量远远超过其原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷负荷的差异。 测定蛋白质分子量 当蛋白质分子量为17,000～165,000时，复合物电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：lgMW=lgK－bm MW —— 蛋白质分子量； m —— 相对迁移率； K —— 常数； b —— 斜率 。 ③ 凝胶色谱 凝胶层析原理 凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。 凝胶色谱分离 凝胶色谱分离的应用 生物大分子物质的分离纯化 分子量的测定 分级分离 溶液浓缩 平衡常数的测定 细胞及颗粒的分离 分子量的测定 蛋白质通过凝胶柱的速度，即洗脱体积与其分子量有关: ④ 离子交换色谱 定义: 利用离子交换树脂作为支持物，将带有不同电荷的Pr进行分离的方法。 分类:阳离子交换树脂,如羧甲基纤维素等， 阴离子交换树脂,如二乙基氨基乙基纤维素 ⑤亲和层析法 亲和层析的特点 纯化效率极高：亲和层析由于配体与待分离物质进行特异性结合，所以分离提纯的效率极高，提纯度可达几千倍 。 SDSseparates proteins by MW 十二烷基硫酸钠 利用生物大分子的相对分子质量差异，进行层析/色谱分离的方法。 凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药在研究和生产中必不可少的分离介质。 凝胶层析介质是惰性球状凝胶颗粒，内部为多孔网状结构，形成很多孔穴。 洗脱体积 LogM=k1-k2Ve （Ve为洗脱体积） 先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。 LogM A B C LogM测 V测 原理:带正电荷多的Pr与树脂结合较强，而带正电荷少的Pr与树脂结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的Pr进行分离。 带正电荷多蛋白紧密结合 带负电荷多蛋白流过层析柱 阳离子交换树脂工作示意图 离 子 交 换 色 谱 柱 层 析 琼脂糖凝胶 连接臂 蛋白质分子 配体 蛋白质 蛋白质和配体复合物 交联试剂 载体 配体 载体与配体交联体 杂质 杂质 游离配体 亲 和 色 谱 * 四.生物药物的制备 3.蛋白质类药物的分离纯化方法 生产过程 上游构建 （基因工程） 发酵生产 (发酵工程) 纯化制备 ● 来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞； ● 分离和纯化过程都必须在温和条件下进行。 蛋白质的分离纯化 产物特性 作用 等电点 决定离子交换种类及条件 相对分子量 选择不同孔径的介质 疏水性 与疏水、反相介质结合的程度 生物特异性 决定亲和配基 溶解性 决定分离体系及蛋白浓度 稳定性