拟南芥TDNA插入突变体的鉴定.pdf

优质文本

遗传学实验报告

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

一、实验目的：

1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操

作技能

2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。

二、实验原理

1、拟南芥（Arabidopsisthaliana）

十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。

➢植株形态个体小，高度只有30cm左右；

➢生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；

➢种子多，每株可产生数千粒种子；

➢形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；

➢遗传转化简单，转化效率高；

➢基因组小，只有5对染色体，125MB；

➢在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。

2、突变体

突变体是遗传学研究的最重要材料。

突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。

拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。

由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的

T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。

3、T-DNA插入突变原理

T-DNA，转移DNA（transfeedDNA），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可

以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA

区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。

除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲

除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。

4、T-DNA插入突变体PCR鉴定

图1结果鉴定图2PCR引物设计

1/3

优质文本

三、实验材料

1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；

2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；

3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq

buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。

四、实验步骤

1、植物DNA提取方法（CTAB法）

1)水浴加热CTAB提取液至65℃；

2)取叶片100mg,液氮研磨成粉末；

3)加入600µlCTAB提取液并混匀；

4)65℃水浴45min（至少30min）；

5)12,000rpm离心10min；

6)将上清转移到新离心管，加入等体积氯仿/异戊醇,混匀；

7)12,000rpm离心5-10min,将上清液转移到新管中；

8)向上清中加入1/10体积3MNaAc,再加入预冷的等体积异丙醇或2V无水乙醇,混匀冰上

放置10min；

9)12,000rpm离心10min，弃上清，加入500µl70％乙醇洗涤2min；

10)12,000rpm离心5min，弃上清，吸干残留并干燥；

11)加20-50µlTE缓冲液溶解DNA。

2、PCR反应

1)引物设计

➢LP:5’-TCATCCACCATGGAAGAAAAG

➢RP:5’-TTGGATACGATGCGAGTAAAC

➢BP:5’-TTGTTCACGTAGTGGGCCATCG

➢LP+RP:1107bp

➢BP+RP:560-860bp

2）PCR反应体系

➢H2O:12.4μl

➢10×Buffer:2μl

➢dNTP:0.5μl

➢MgCl2:2μl

➢LP/BP:0.5μl

➢RP:0.5μl

➢Taq:0.1μl

➢DNA:2μl

➢Total:20μl

3)PCR温度设定

➢94℃5min

2/3

优质文本

➢33cycle

变性：94℃30s