DNA多态性分型技术2013年.ppt

RFLP与PCR-RFLP的应用 结核分枝杆菌IS6110-RFLP分析 厌氧菌16SrRNA基因PCR-RFLP分析 其他 二、随机扩增多态性DNA分析技术 random Amplified Polymorphism DNA， RAPD 以PCR技术为背景，以人工合成的碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，经电泳分离后产生DNA指纹图谱。 模板DNA经92～94℃变性解链后，在较低温度下退火，此时，有许多位点能与随机合成的短引物互补而形成双链结构。如果某两位点间在可扩增范围之内，且分别位于互补的两条单链上，并且与引物的3’端相对应，就可以通过PCR得到一个扩增产物。 基 本 原 理 RAPD所用的一系列DNA引物序列各不相同，但对于任意特定引物，它同基因组DNA序列有其特定结合位点，如果基因组在这些区域发生片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应变化，而使PCR产物增加、减少或发生分子量改变，产生多态性图谱。 基 本 原 理 总DNA提取 随机引物合成 PCR扩增 随机引物筛选 电泳检测 图谱分析 ①采用随机引物，无需预先知道被研究生物基因组核苷酸序列； ②引物短，在整个基因组内的结合位点多，2种甚至多种引物可混用； ③成本较低； ④操作简便，快速； ⑤DNA分析效率较高； ⑥所需DNA样品少。 优 点 ①重复性不高（最大缺点）； ②只能区分不同大小的片段，而不能区分有不同碱基序列但大小相同片段； ③需对引物进行筛选，难以进行标准化。 缺 点 三、细菌基因组重复 序列PCR技术 （repetitive-element PCR, rep-PCR） ——一种基于PCR的DNA标记技术 rep-PCR技术是利用基因组中广泛分布的短重复序列（repetitive sequences)为引物进行PCR扩增，通过对PCR产物的电泳结果进行比较，来分析菌株间基因组存在的差异。 rep-PCR-原理 目前研究最多、最常用的细菌基因组短重复序列有： rep-PCR-短重复序列 基因外重复回文序列 （Repetitive Intergenic Palindrome,REP) 肠细菌基因间共有重复序列 （Entero-bacterial Repetitive Intergenic Consensus, ERIC) 两者的共同特征是它们在细菌基因组中存在着菌株、种、属水平上的分布和拷贝数量的差异，而序列本身在进化过程中又具有较强的保守性。 基于这两种短重复序列的PCR就成为rep-PCR的2个重要的技术——REP-PCR和ERIC-PCR。 rep-PCR-短重复序列 两种短重复序列的特点及功能： 基因外重复回文序列（REP）又称回文单位，其结构特点是回文性质，其转录的mRNA有形成茎-环（stem-loop）结构的潜能。 REP家族序列由38bp构成，含有6个非常保守的位点及5bp构成的位于非常保守的回文臂之间的保守环。 REP序列 rep-PCR-REP序列 REP家族序列广泛分布在大肠埃希菌和沙门菌基因组内(提示什么？）。REP序列可以单独出现或增加为4个串联的重复单位。在E.coli的染色体上，存在500到1000个的REP串联重复单位，在沙门菌上REP串联重复单位约占基因组的1%。 rep-PCR-REP序列 REP序列的功能： rep-PCR-REP序列 转录终止作用； 稳定mRNA； 在体内染色体区段的组织作用。 根据REP这段高度保守的重复序列设计引物，扩增两段REP之间的片段，扩增产物的数量和片段长短的不同就直接反映了基因组DNA的差异，从而可对菌株进行分型和同源性分析，这就是rep-PCR技术中的REP-PCR技术。 rep-PCR-REP-PCR技术 肠细菌基因间共有重复序列（ERIC）长约126bp，其中包含几个反向重复序列，具有非常保守的中央倒置重复区，转录后的mRNA形成茎-环结构。 当茎环结构中位于茎部位的一个碱基发生改变时，与其相对应的碱基也要发生相应的改变，从而保证二级结构的稳定。 rep-PCR-ERIC序列 结构特点 ERIC序列的功能目前还不太清楚，在一些研究中，ERIC被认为： 可能有助于相邻基因的表达； 也可能与细菌基因组局部区域的组织有关； 或认为位于基因3‘末端的ERIC可防止外切核酸酶对基因3’末端的降解。 rep-PCR-ERIC序列 功 能 依据ERIC重复序列设计引物，对细菌基因组DNA进行扩增，可产生DNA