东师实验1血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定详解.doc

综合研究性实验一： 血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定 一.实验目的 2.掌握透析法脱盐与蛋白质浓缩的方法； 3.掌握凝胶过滤层析的技术方法； 4.掌握利用醋酸纤维素薄膜电泳法分离与鉴定血清清蛋白的原理和方法。 二.血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析、透析与浓缩 1.试剂 （1）血清 （2）PBS （3）(NH4)2SO4溶液 （4）双缩脲试剂 （5）酪蛋白 （6）蔗糖 （7）蒸馏水 （8）BaCl溶液 2.用品与仪器 （1）离心机 （2）烧杯 （3）移液管 （4）透析袋 [二]血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析 （一）蛋白质盐析的实验原理 2.蛋白质在水中形成亲水胶体，亲水胶体颗粒有两个稳定因素： （1）胶粒上的电荷； （2）水化膜。 3.蛋白质在水溶液中呈现两性电离。在环境的pH≠pI时，蛋白质可带正电荷或负电荷。在某一pH条件，蛋白质带同种电荷，同电相斥，故可吸引水分子（水分子为极性分子），水分子排列围绕在蛋白质分子周围，形成水化膜，使蛋白质分子相互分割开来。破坏这两个因素或其中某一个因素（破坏了蛋白质胶体的稳定性），易于蛋白质发生沉淀。 4.高浓度盐溶液，在水溶液中电离，其正、负离子吸引水分子，从而夺取水化膜，还可以中和部分电荷。这样，就不同程度地去掉了上述的两个稳定因素，使蛋白质凝聚、沉淀，这就是蛋白质的盐析。 5.由于各种蛋白质的颗粒大小、带电荷多少及亲水程度的不同，对于同一种中性盐，蛋白质盐析所需最低浓度也不同。 例如：球蛋白不溶于半饱和的(NH4)2SO4溶液，γ-球蛋白不溶于1/3饱和度的(NH4)2SO4溶液，而清蛋白仅不溶于饱和的(NH4)2SO4溶液。因而。可以利用不同浓度的(NH4)2SO4溶液使血清或其他混合蛋白质中的这些不同的蛋白质分开。 （二）血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析实验步骤 -球蛋白的盐析实验步骤 取离心管一支，加入2mL血清 加入2mLPBS（稀释血清），摇匀 逐滴加入pH=7.2的(NH4)2SO4溶液2mL，边加边摇 静止30min，离心20min（v=3000rpm） 上清液（主要含有清蛋白） 沉? 淀（主要含有γ-球蛋白） 加入3.132g(NH4)2SO4，使上清液饱和 加1mLPBS溶解 静止30min 逐滴加入饱和(NH4)2SO4溶液0.5mL (相当于33%饱和 (NH4)2SO4溶液) 离心、沉淀 加1mLPBS溶解沉淀 放置30min 放入透析袋 离心20min（v=3000rpm）* *放弃离心后的上清液（主要是α、β球蛋白），沉淀即为初步纯化的γ-球蛋白 （一）蛋白质透析与浓缩的实验原理 （1）透析是利用蛋白质等生物大分子不能通过半透膜的性质的一类纯化方法，可利用该方法分离大分子与小分子的混合物。 （2）由于NH4+和SO42-可以通过半透膜，而血清清蛋白不能，因此，可以利用透析的方法使清蛋白溶液脱盐。 2.浓缩 利用半透膜还可以进行大分子溶液的浓缩。 将盛有待浓缩的大分子溶液的透析袋放入高浓度的吸水性强的蔗糖固体颗粒中，袋内溶液中的水被袋外的多聚物所吸收而有效地浓缩。 （二）蛋白质透析与浓缩的实验步骤 1.15cm×15cm）两张，折成袋状。将前面第一次盐析得到的含有清蛋白的上清液和γ-球蛋白分别倒入两个透析袋中，用线绳系紧上口。 2.用玻璃棒悬挂在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯中，使透析袋下半部浸入水中，将烧杯放在微量振荡器上振荡1h（中间换水1-2次）。 3.将透析袋取下，小心将线绳解开，用滴管吸收袋内的液体放入干净的试管中。 4.用双缩脲法分别检查袋内外液体蛋白质。在用BaCl溶液检查烧液体的NH4+和SO42-。记录实验现象，观察透析法除盐的结果。 溶液名称 所加试剂名称 实验现象 分光光度计读数 蒸馏水 双缩脲试剂4mL ? ? 酪蛋白 双缩脲试剂4mL ? ? 袋内溶液 双缩脲试剂4mL ? ? 袋外溶液 双缩脲试剂4mL ? ? 袋外溶液 BaCl溶液 ? —— 除盐结果 ? 5.将两透析袋取出，埋入蔗糖中浓缩。 三.凝胶层析 1.凝胶层析也称凝胶过滤，是一类利用有一定孔径范围的多孔凝胶的层析技术。 2.当样品流经这类凝胶的固定相时，不同分子大小的各组分因进入网孔受阻滞的程度不同而以不同的速度通过层析柱，从而达到分离的目的。 3.当样品通过层析柱时，分子量较大的物质因为不能或较难通过网孔而进入凝胶颗粒，而是沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动的速度较快，即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱；反之，分子量较小的物质，因为颗粒直径小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程较长，向前移动的速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚。 本实验用的是重