基因编辑神器：CRISPR-Cas9技术.pdf

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剪刀手：CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas系统是细菌获得性免疫的重要组成部分，由Cas核酸酶和两种单独的RNA成分组成，即可编程crRNA（CRISPRRNA）和固定的TracRNA

（反式激活crRNA）。

2012年，JenniferDoudna和EmmanuelleCharpentier发现Cas9可以当作DNA切割工具，CRISPR/Cas9技术才真正开始受到广泛关注。

CRISPR/Cas9调控机制

1.CRISPR的转录：CRISPR被转录成一条长RNA（pre-crRNA），包含了重复序列和间隔序列。

2.tracrRNA的转录：tracrRNA转录成tracrRNA。

3.CRISPR/Cas9复合物的成熟：tracrRNA与pre-crRNA结合，经过外源RNaseIII的剪切，Cas9也参与crRNA成熟。tracrRNA与crRNA融合即sgRNA，

并与Cas9结合。

4.靶标识别：CRISPR/Cas9复合物扫描入侵的DNA，寻找与crRNA间隔序列互补的序列。识别过程中，crRNA的间隔序列与目标DNA（即gRNA）的特定

序列（原间隔短回文重复序列邻近基序，PAM）配对。

5.DNA切割：一旦找到匹配的序列，核酸酶Cas9就在PAM位点附近切割DNA双链。核酸酶Cas9有两个核酸酶结构域，HNH结构域切割DNA的一条链，

RuvC结构域切割另一条链。

6.DNA修复：细菌或细胞通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）机制修复DNA断裂。NHEJ通常会导致插入或缺失（indels），而HDR可

以精确修复DNA，如果提供了修复模板的话。

注：CRISPR/Cas9系统的调控：在自然状态下，CRISPR/Cas9系统的激活是被动的，一旦crRNA与Cas9结合，系统就处于待激活状态。可以通过设计

特定的gRNA来调控CRISPR/Cas9系统，使其靶向特定的基因序列。

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图1：CRISPR/Cas9调控[1]

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图2：CRISPR/Cas9剪切后的DNA修复[1]

CRISPR/Cas9的基因调控

CRISPR/Cas-9介导的基因组编辑已成为治疗开发和生物医学研究中一项潜在的创新技术。CRISPR/Cas9技术由于其灵活性、简单性、高效性和精确基因组编

辑的多重性而为疾病治疗带来了巨大的希望。

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1.GM-CSF：CRISPR/Cas9介导的GM-CSF敲除，并与野生型CART细胞相比，GM-CSFk/oCART细胞产生较少的GM-CSF而不减弱体内抗肿瘤活性。

[2]

图3.A在野生型CART19和GM-CSFk/oCART19上具有相似CAR表达的成功CAR-T细胞生产。B通过细胞内染色检测，在