第三章核酸.解读.ppt

1、碱基 2、核苷 碱基与戊糖环的1’-位碳原子以共价糖苷键相连，形成的产物称为核糖核苷（简称核苷） RNA中的戊糖为核糖，而DNA中的戊糖为2’-脱氧核糖，即2’-位羟基被氢原子取代 核糖与碱基连接而成的核苷分别称为腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷，而脱氧核糖与碱基连接而成的核苷分别称为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧胸苷 3、核苷酸 核糖核苷与磷酸基以共价键连接成为核苷酸，脱氧核糖核苷的连接产物称为脱氧核苷酸 就其化学本质而言，上述连接产物为磷酸酯 三、RNA二级结构 在正常情况下，RNA以单链形式存在，但分子内的互补碱基区域可通过氢键结合形成干-环结构或发夹结构等二级结构 RNA构型多样性与其功能多样性有关 细胞核内小RNA参与前mRNA的剪切 微干扰RAN（miRNA)参与基因表达的调节 信使RNA（mRNA)携带指导蛋白质合成的指令 转移RNA（tRNA)负责氨基酸的识别与转运 核糖体RNA（rRNA）与蛋白质形成核糖体，参与蛋白质的合成 四、核酸的修饰加工 核苷酸或碱基的化学修饰非常普遍，并且具有功能上的重要性 细胞DNA的化学修饰仅限于腺嘌呤N-6位和胞嘧啶5-位及4-氨基的甲基化（methylation） 噬菌体DNA可以发生更为复杂的化学修饰，这些化学修饰对限制性修饰、碱基错配修复和真核基因组结构具有重要意义 RNA在转录之后可以发生多种化学修饰，反映RNA在细胞内扮演多种角色 第二节 核酸特性 一、结构稳定性 DNA双链之间以氢键连接，但氢键是一种次级键，能量较低，易受破坏 在双螺旋DNA中，氢键主要与碱基配对的特异性有关，但不能提供螺旋结构的总体稳定性，稳定的根本原因在于疏水性碱基之间的相互堆叠 温度是影响核酸结构稳定性的主要因素，双链DNA在高于一定温度时会发生解双螺旋作用，这个温度常用Tm值来表示 二、对酸的敏感性 强酸和高温（如高氯酸和大于100℃）能将核酸彻底水解成碱基、戊糖和磷酸基等组成部分 在pH3-4的条件下，较低浓度的无机酸能选择性破坏核酸的低能键（如嘌呤与戊糖之间的糖苷键），产生所谓的脱嘌呤核酸 Maxam和Gilbert根据上述原理,用化学物质使核酸在特定的碱基处裂解，发明了核酸化学测序法 由于酸性环境对核酸具有不利影响，所以在配制核酸溶液和保存核酸时应加以注意 三、 DNA对碱的敏感性 pH7-8对DNA结构影响不大，但较高pH能引起碱基的互变异构 鸟嘌呤等碱基在中性pH时以酮式为主，但在较高pH时则以烯醇式为主，这种互变异构影响碱基之间的特异结合，导致DNA解链或变性 实际应用： 利用碱对DNA的变性作用,建立了制备质粒DNA的的碱性溶解法 在核酸杂交试验中,常用碱处理法使双链DNA解链,以便与单链探针DNA结合 四、 RNA对碱的敏感性 较高pH能使RNA局部互补区变性，但这种效应常被RNA对碱水解的高度敏感性掩盖 即使在中性pH环境中，RNA也较DNA更易水解，实验操作时应特别注意 根据上述原理，可用碱处理法去除DNA样品和器具上的RNA污染 五、粘度 细胞DNA是非常纤细的分子，其直径约为2纳米，而长度可达数微米或毫米，真核细胞染色体DNA的长度甚至超过几公分，所以DNA溶液的粘度（viscosity）很高 细长的DNA分子容易受到机械剪切力（如超声波）的破坏，并伴随粘度的降低 机械剪切力和超声波仅能使双链DNA的长度降低，但不能使DNA变性（解链） 对制备高质量基因组DNA来说，应尽量避免机械损伤，如吸取DNA溶液时所用滴头不宜太细、用力不应过猛，混旋DNA溶液时不宜过分震荡 六、浮密度 DNA的浮密度约为1.7g cm-3 DNA浮密度主要与其G+C含量有关,因此DNA浮密度测定可用于G+C含量分析 纯化质粒DNA的氯化铯平衡密度梯度离心法即根据浮密度原理设计，是大量制备高纯度质粒DNA的经典方法，但具有费时、溴乙锭（致癌物质）污染和需要复杂的仪器设备（如超速离心机等）等缺点，现已逐步被使用方便的试剂盒取代 七、紫外吸收特性 核酸中的嘌呤和嘧啶都含有共轭双键，在紫外260nm波长处有最大吸收峰，这个性质可用于核酸的定量测定 减（低）色性是指与RNA和单链DNA相比，双链DNA具有较低的光吸收值 在热变性过程中，随着双链DNA解链成单链，其紫外吸收值也随之升高 核酸浓度计算公式为： ?g/ml dsDNA=OD260×50×稀释倍数 ? g/ml RNA=OD260×40×稀释倍数 ? g/ml ssDNA=OD260×33×稀释倍数 根据OD260/OD280比值可进行核酸纯度评定，高纯度DNA的比值约为1.8， 1.8提示样品有RNA污染，1.8提示样品有蛋白质污染 八、变性与复性 化学物质（如尿素、甲酰胺）以及高温能破坏核酸的双链氢键