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基因芯片技术 朱丽雅 ０６／１１／１３ 生物芯片(Biochip)技术 　 通过加工工艺同时将大量的探针分子固定到固相支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息并进行高效的解读和分析． １.基因芯片 ２.蛋白质芯片 ３.芯片实验室 命名： “GeneChip”—— Affymetrix率先专利注册 Microarray，DNA微阵列——通用 地位 80年代——克隆， 90年代—— PCR； 21世纪——芯片 Microarray——近10年来生命科学研究领域中的最高效技术之一 优点 传统：Northern杂交、RT-PCR和核酶保护性分析等——只针对单个基因来分析 Microarray：高通量模式 研究效率——提高成千上万倍 研究层面——总体全局的基因之间相互关系 广泛应用——基础研究方面如基因表达水平的检测、基因间相互作用模式、基因诊断、测序；产业化方面也有药物筛 选、药物基因组图谱、个性化治疗、中药物种鉴定、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督等许多领域。 基本工作流程以Affymetrix GeneChip为例． 样 品制备 样品 DNA样品 RNA样品——先逆转录成cDNA 　　 　样品核酸的拷贝数提高达到检测的灵敏度 　样品或后续测试信号适当的放大 　样品扩增 　　　 　　同时对样品核酸分子大量的区域进行扩增　 e.g. PCR  　 　去除了多余 的RNA （rRNA占约80%）, RNA污染增加非特异性扩增 标记 方法 　标记引物 标记三磷酸脱氧核糖核苷酸 标记物： 荧光分子直接标记 生物 素间标——放大信号 　　 荧光标记: 　　单色标记——以减 少流程或者芯片制作过程中所造成　　　　　　　　　 　　　　　　　　的控制性差异，确保实验的可靠性和可重复性。 　　双色标记——用不同颜色荧光素标记两个引物 杂交反应（关键） 通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配比率，从而获取最能反映生物本质的信号。 dsDNA芯片 　单链 DNA（ 寡核苷酸）芯片——有助于防止双链DNA在杂交时产生干扰，而且芯片上各点寡核苷酸长度相对一致，使得杂交条件较为一致，有助于减少由于双链 DNA长度差别导致杂交条件差异的问题。 按载体上所点探针的长度分为： (1) cDNA 芯片:由Schena 建立,将特定的cDNA 经PCR 扩增后借助机械手直接点到基片上。 (2) 寡核苷酸芯片:由Fodor首先报道,用照相平板印刷术和固相合成技术在基片上生成寡核苷酸, 分为长寡核苷酸芯片和短寡核苷酸芯片,与cDNA 芯片制作的一个主要不同点是多一步转录获得cRNA 的过程。 起初,人们认为长寡核苷酸芯片和cDNA芯片有更高的特异性和灵敏度。但短寡核苷酸芯片同样有效和特异。 信号检测 　芯片上点的高集成度要求高灵敏度的检测设备。 双色标记为例： １.芯片 扫描仪采集各反应点的荧光强弱和荧光位置 ２.对每一种染料扫描　一定的软件处理并合并得到每个点的重叠图　 　 ３.点数和每点的强度定量确定，确定背景强 度并被减掉　　 　　　　 ４.对照点，或是额外加入的序列，或是报道基因，或是每个样本的总的荧光信号强度，来帮助校正两种荧光染料的标记差异和检测效率 ５.两个样本中的每 个基因信号用控制好的强度进行扫描测量　 ６.经相关软件分析图像，即可以获得有关生物信息。 芯片的扫描灰度图 数据分析（复杂） 一位科学院院士说，“以后生物实验室中要有50%-70%的人从事生物信息学工作”呢。而且据统计，国际生物芯片的专利62%都集中在数据分析领 域，可见这一方面确实是芯片研究领域的重点和焦点。 很多芯片产品的供应商都有提供服务项目。 靠自己 　数据的描述 目的：是通过图形对数据的分布情况进行初步的判断。 散点图是一种常用的方法. 远离对角线的基因为表达差异明显的基因。 聚类分析 计算样本（这里指芯片上各个点扫描得到的数据）间的距离，以判断性质是否相近． 聚类方法的局限: １. 要聚类结果要明确就需分离度很好的数据 ２.由线性相关产生。但生物系统却具有多因素和非线性的特点点, 往往进行简单的分类是无效的。 层次式聚类：计算各数据点间的距离后把相近距离的聚为一组, 再计算各组间的距离使之合并成更大的组, 不断重复这一过程直到最后聚成一组以树状结构重新安排的数据. 其结果直观而且能以树状结构分支的长短来评价基因的