闽江河口芦苇湿地硫酸盐还原菌的多样性研究.doc

闽江河口芦苇沼泽湿地硫酸盐还原菌的多样性研究 【摘 要】为了深入揭示闽江河口芦苇湿地的硫元素代谢循环，采用PCR-RFLP技术对芦苇湿地土壤表层的硫酸盐还原菌多样性进行了研究。在构建的克隆文库中，随机挑取100个克隆进行菌落PCR验证，共得到97个阳性克隆,阳性率为97%。阳性克隆的PCR产物利用限制性内切酶进行酶切分析。结果表明，闽江河口芦苇湿地土壤表层的硫酸盐还原菌经RFLP分析可得到20个不同的分类操作单元(OTUs),其中以OTU-2（11）、OTU -3（23）、和OTU -19（19）为主。Shannon多样性指数（H ′）和Simpson多样性指教（D）计算结果显示，土壤表层（0—10 cm）的Shannon指数（H′）为.49，Simpson多样性指教（D）为.114。 【关键词】硫酸盐还原菌；多样性；PCR-RFLP；芦苇湿地 1．引言（查文献进行修改）1000字 通过对闽江河口芦苇沼泽湿地硫酸盐还原菌的多样性研究，闽江沿岸芦苇湿地土壤呼吸的昼夜变化和季节变化进行测量,结果表明:在最高水位土壤表面未淹水的状态下,不同季节的土壤呼吸日动态没有一致的规律性,土壤温度和土壤体积含水量不是土壤呼吸日变化的主要影响因子;而在最高水位土壤表面淹水的状态下,水位对土壤呼吸强度有一定影响:当土壤表面被淹没时,土壤呼吸强度约为0;当水位下降时,土壤呼吸强度增加.土壤呼吸的季节变化呈单峰形式,5 cm处土壤温度仅能解释土壤呼吸季节变化的49.4%,而土壤体积含水量对土壤呼吸季节变化无显著影响.? 有关湿地硫循环的相关研究进展(补充) 有关硫酸盐还原菌菌本研究从闽江河口芦苇湿地土壤中提取微生物宏基因组DNA，菌的AB基因，利用胶回收试剂盒进行AB基因基因的回收及纯化，为进一步研究河口湿地菌提供基础2．材料与方法 2.1　主要仪器和试剂 2.1.1 主要仪器： PCR扩增仪、自动凝胶成像分析仪、冷冻高速离心机、台式高速离心机、核酸电泳仪、涡旋混合仪、低温冰箱、高压蒸气灭菌锅、测定仪、移液枪等。 2.1.2 主要试剂：土壤DNA提取试剂盒、琼脂糖、Tag DNA聚合酶、EB、200bpDNA Ladder 、0bpDNA Ladder 、Promega 胶回收试剂盒等，以上生化试剂大多为分析纯。 .2 土壤总DNA的提取 0.25 g土壤采用土壤DNA提取试剂盒（MO BIO Laboratories, USA），按厂家操作说明书的方法进行土壤总DNA的提取和纯化。DNA纯度和浓度通过紫外分光光度计 (NanoDrop, USA)进行检测，收集的DNA样品在分析和PCR扩增之前存于－20 备用。 .3 dsrAB基因的扩增及纯化 以提取的土壤总DNA为模板用于扩增大约1900 bp的dsrAB基因片段，扩增引物采用硫酸还原菌的特异性引物DSR1F：（5’-AC[C/ G]CACTGGAAGCACG-3’）和DSR4R：（5’-GTGTAGCAGTTACCGCA-3’）[134]。PCR反应体系为50 μL：10×PCR缓冲液5 μL，dNTP 4 μL，引物各1 μL，0.5 μL rTaq酶，DNA模板1 μL，加灭菌的ddH2O至50 μL。 PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 S，5 ℃退火 S，72 ℃延伸 min，3个循环；最后72 ℃延伸 min。扩增的PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下切下含目的DNA片断的凝胶条带，用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒（Promega，USA），按厂家说明书的方法进行dsrAB基因的回收纯化。 .4 dsrAB基因克隆文库构建 纯化后的dsrAB基因片段按厂家说明书的方法与pMD 18-T vector（Takara，）连接。连接体系为：pMD 18-TvectorμL，目的基因2 μL，灭菌的ddH2O 2 μL，Solution I 5 μL，总体积10 μL。16 ℃过夜连接后，转化入E. coli DH5α感受态细胞。转化产物涂布到含有氨苄青霉素(Ampicillin)/IPTG/X-Gal的LB固体培养基上，37 ℃下培养1624 h，通过蓝白斑筛选方法筛选重组子，白色克隆子即为阳性转化子。挑取阳性转化子构建克隆文库，克隆文库用LB（Amp+）平板4 ℃保藏。 .5 dsrAB基因克隆文库的RFLP分析 为检查整个克隆文库的有效性，在所构建的各个克隆文库中随机挑取100个白色克隆子进行菌落PCR验证。按照厂家说明书的方法对阳性克隆的PCR产物进行HhaⅠ（Takara, ）酶切。酶切体系10 μL： PCR产物4 μL；10× Buffer 1μL；限制性内切酶HhaⅠ 0.5 μL，灭菌的ddH2O