基因工程与分子生物学常用技术完整.ppt

基因工程与分子生物学常用技术;第一节基因工程与基因重组;(一)工具酶;技术及其应用

引物是PCR特异性反应的关键，取决于引物与模板DNA互补的程度。

引物是PCR特异性反应的关键，取决于引物与模板DNA互补的程度。

制备目的基因和相关载体；

将mRNA逆转录合成cDNA，再与载体连接成重组DNA，将其引入宿主细胞并进行扩增，所得分子克隆的混合体称为cDNA文库。

针对载体携带有某些标志基因如抗药性标志基因(ampr、tetr、kanr等)和目的基因而设计的筛选方法。

为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子，称为载体。

是指利用DNA复性原理，把不同来源的DNA单链或DNA与RNA混合，如单链分子间有碱基配对关系，则可形成杂化双链的过程。

制备基因组DNA文库(genomiclibrary)

Northern印迹杂交

(三)将外源DNA导入宿主细胞

能催化单核苷酸转移到DNA的3/-端羟基上。;2.DNA聚合酶;4.逆转录酶;(二)载体;①质粒是细菌中独立于染色质以外的、能自主复制的、并与细菌或细胞共存的遗传成分，可赋予宿主细胞某些遗传性状。

②通常质粒的大小为2～300kb。

③一般只能容纳10kb的外源DNA片断。;(2)噬菌体(bacteriophage，phage);(3)粘粒(cosmid);二、重组DNA技术的基本原理和过程;(一)目的基因的制备;3.聚合酶链式反应(PCR);(1)指将经酶切和电泳分离的待测DNA片段转印到固相支持物上，然后与标记的DNA探针杂交。

②粘粒本身约4～6kb，可克隆DNA大片段，可用作建立真核基因组文库的载体。

三、基因诊断和基因治疗

引物是PCR特异性反应的关键，取决于引物与模板DNA互补的程度。

2．可判断突变的基因片段，如癌基因和抑癌基因中点突变的检测和鉴定。

(3)具有高度特异性；

(三)将外源DNA导入宿主细胞

基因工程中最主要是分子克隆，克隆是指由一个细胞经过无性繁殖后所形成的子代群体。

(2)该方法不需从组织或细胞中提取核酸，有很高的灵敏度，并可保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

常用的方法有以下两种：

制备cDNA文库(cDNAlibrary)

将mRNA逆转录合成cDNA，再与载体连接成重组DNA，将其引入宿主细胞并进行扩增，所得分子克隆的混合体称为cDNA文库。

(2)选择基因转运载体：通常选择病毒载体。

法医学中个体识别、亲子鉴定

若采用狭缝点样器加样后杂交，其印迹为线状，称为狭缝印迹杂交。

①粘粒是将λ噬菌体的cos区与质粒组合的装配型载体。

5′???CTGCA↓G???3′5′???CTGCAG???3′

是指利用DNA复性原理，把不同来源的DNA单链或DNA与RNA混合，如单链分子间有碱基配对关系，则可形成杂化双链的过程。;(三)将外源DNA导入宿主细胞;1.遗传学方法

针对载体携带有某些标志基因如抗药性标志基因(ampr、tetr、kanr等)和目的基因而设计的筛选方法。

2.分子杂交方法

利用32P标记的探针与重组DNA或克隆DNA片段进行分子杂交，直接筛选并鉴定目的基因。

3.免疫学方法

利用特异性抗体与目的基因表达产物特异结合的方法筛选。;(五)克隆基因的表达;2.特点针对性强、特异性强、灵敏度高、适应性强。;1.基因治疗是指以正常基因矫正、替代缺陷基因，或从基因水平调控细胞中缺陷基因表达的一种治疗疾病的方法。

2.狭义的基因治疗是指将目的基因导入靶细胞，与宿主细胞的基因整合后表达以达到治疗疾病的方法。

3.广义的基因治疗是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用以达到治疗疾病的方法。;5.基因治疗的基本程序;(TheTechnologyandApplicationinMolecularBiology);(一)探针(probe);(二)核酸分子杂交的基本方法;3.斑点及狭缝印迹杂交

(1)指将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再与探针杂交，称为斑点印迹。若采用狭缝点样器加样后杂交，其印迹为线状，称为狭缝印迹杂交。

(2)主要用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究。;二、聚合酶链反应;n个循环;PCR反应体系：

1.引物是PCR特异性反应的关键，取决于引物与模板DNA互补的程度。

2.酶浓度酶催化的PCR反应的TaqDNA聚合酶量约需2.5U。

3.dNTP的质量dNTP的质