-1培养诱导乳腺癌患者自体CIK细胞的研究.doc

培养诱导乳腺癌患者自体CIK 细胞的研究 探讨获得大量乳腺癌患者自体树突状细胞（dendritic cells, DCs）和细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced cells, CIK 细胞）的可行性。 乳腺癌患者经外周血干细胞动员，取 50 mL 外周血分外周血单个核细胞（PBMC），用 AIM-V 无血清培养基培养 DCs 和 CIK，并设健康人对照组，用 RPMI 1640 完 全营养培养基。结果 实验组 PBMC 产出 2×108 个并诱导出 1.2×107 个 DCs 和 2×109个 CIK 细胞，显著高于对 照组（P 0.01）。DCs 的 CD86、CD11c 和 HLA-DR 分子都有较高表达，CIK 细胞 CD3+、CD56+双阳性细胞达 到14.41%。细胞毒实验提示 CIK 细胞有强大的杀瘤活性。结论 乳腺癌患者经外周血干细胞动员，用AIM-V 无 血清系统培养，少量外周血可诱导大量优质自体 DCs 和 CIK 细胞。 树突状细胞（DCs）是目前发现功能最强的专职抗原呈递细胞（APC），是唯一能激发静息的 T 细胞产生免疫应答的 APC，在肿瘤免疫中具有极其重要作用。CIK 细胞是非 MHC 限制细胞毒性淋巴细胞，CIK 细胞的主要效应细胞是高度增生的 CD3+、CD56+双阳性表型 T 细胞，又被称为 NK 细胞样 T 淋巴细胞，兼具有 T 淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和 NK 细胞的非限制性杀瘤优点，在体外可大量扩增，DCs 和 CIK 细胞理想的过继性免疫治疗细胞。但临床应用仍受到很大限制，一是由于常规培养基含有异种血清，二是常规由患者 PBMC 诱导达到治疗量自体 DCs 和 CIK 细胞，需大量外周血。我们对乳腺癌患者进行外周血干细胞动员和用 AIM-V 无血清培养基培养，探讨获得大量自体 CDs、CIK 细胞和建立符合临床治疗标准的培养诱导系统的方法。 动员乳腺癌患者外周血干细胞和分离外周血单个核细胞 乳腺癌患者皮下注射 GM-CSF 6 g·kg-1·d-1，共 5 d，第 6 天抽取外周血 50 mL，为实验组。同时取等量健康人外周血做为对照组。用 Ficoll 密度梯度离心法分离 PBMC，分离步骤按产品说明。 诱导 DCs 采用 GM-CSF、IL-4 和 TNF-α诱导 DCs。用 AIM-V 无血清培养基将实验组 PBMC 密度调到 5×106，在 75 cm2 培养瓶，37℃、5% CO2、培养 2 h。洗去并收集非贴壁细胞备用诱导 CIK 细胞。贴壁细胞用含 800 U/mL 人重组 GM-CSF 和 500 U/mL 人重组 IL-4 的 AIM-V 无血清培养基培养，每 3 天更换新培养基及细胞因子，第 5 天加入 50 U/mL 人 TNF-α，第 7 天收获成熟 DC。对照组采用 RPMI 1640 培养基培养（含 10% 灭活胎牛血清， 2 mmol/L L-glutamine、50 mol/L 2-mercaptoethano，P-S 双抗 100 U/mL），细胞因子及培养方法同实验组。 诱导 CIK 细胞 参照 Wolf CIK 细胞诱导法，并做必要修改。用 AIM-V 无血清培养基将实验组非贴壁 PBMC 密度调至 1×106，第 0 天培养基内加入 1 000 U/mL，培养 24 h 后加入抗 CD3 单克隆抗体 50 ng/mL，IL-1 100 U/mL 和 IL-2 300 U/mL。每 3 d 更换新培养基和细胞因子并调整细胞密度至 2×105。对照组用 RPMI 1640 培养基培养（含 10% 灭活胎牛血清，2 mmol/L L-glutamine、50 mol/L 2-mercaptoethano，P-S 双抗 100 U/mL，25 mmol/ L· HEPES），细胞因子及培养方法同实验组。 流式细胞 检测 DC 表型 CD86、CD11c 和 HLA-DR，检测 CIK 表型 CD3 和 CD56。 细胞毒分析 采用乳酸脱氢酶释放法检测 CIK 细胞的细胞毒活力。方法简述如下：在 U 形底 96 孔板行细胞毒检测每孔置靶细胞 Bel-7402 10 000 个/100 L，自然释放孔内靶细胞10000/200L，最大释放孔内置靶细胞 10 000/200 L 含 1% TritonX-100，背景孔内置 200 L 培养基，实验孔每孔含靶细胞 10 000 个/200 L 和不同数量 CIK 细胞，效靶比例为 5:1、10:1、20:1 和 40:1，效应细胞自然释放孔每孔置等量 CIK 细胞，以上均复置 3 孔。在 5% CO2，90% 湿度，37 培养 4 h 后，将每孔培养