基因组测序与序列组装.ppt

基本原理DNA芯片测序将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上,每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测的DNA分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装,拼接成完全的DNA顺序.利用基因芯片进行杂交测序的原理4序列的组装4.1随机测序与序列组装随机测序也称”鸟枪法”.序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸.优点:不需预先了解任何基因组的情况.ABCABCABCABC小片段测序计算机拼装A1B2C3小片段测序4计算机拼装5鸟枪法(Shotgun)测序的问题6CAATGCATTA……GCAGCCAATGC7GAP8错装9实例:流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装超声波打断纯化的基因组DNA↓琼脂糖电泳收集1.6～2.0Kb的区段、纯化↓构建到质粒载体中↓随机挑选19687个克隆,进行28643次测序,得到可读顺序为11631485bp↓组装成140个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群,↓各重叠群间仍有间隙顺序间隙物理间隙↓↓载体或宿主菌选用不当而被丢失的顺序测序时遗漏的测序解决办法:通过相邻已知顺序作为探针筛选已有的基因组文库解决办法:利用其它宿主菌与载体重新构建文库4.2限制测序限制测序：是指将一段染色体区段的DNA顺序进行组装.如高等植物拟南芥基因组的测序完全依据克隆重叠群,先进行各个BAC克隆的随机测序,再进行序列组装；一些已绘制了遗传图与物理图的微生物基因组测序中也采用这一方法.水稻基因组测序计划采取得策略与此相同.4.3指导测序与序列组装建立在基因组图谱基础上的”鸟枪法”,即所谓”指导鸟枪法”或”指导测序”。在人类基因组进入测序组装阶段就采用此方法，其基本步骤如下:构建平均为2Kb的人类基因组质粒文库,进行双向测序;构建平均10Kb的人类基因组质粒文库,进行双向测序,读取2个端部顺序;参考人类基因组图,特别是大量的STS位标作为基点,进行序列组装，排成重叠克隆群.先将染色体打成比较大的片段(几十-几百Kb),利用分子标记将这些大片段排成重叠的克隆群(Contig),分别测序后拼装.这种策略叫基于克隆群(contig-based)的策略.ABCABC大片段contig小片段测序拼装01鸟枪法策略指导测序策略不需背景信息构建克隆群(遗传、物理图谱)020304时间短需要几年的时间需要大型计算机得到的是草图(Draft)得到精细图谱0506两种策略的比较重要区域优先测序4.5其他测序路线人们对感兴趣的基因或与疾病相关的基因优先测序.如:人类主要组织相容性复合区位于第6号染色体,与人类免疫系统有关，因而优先测序.EST(Expressedsequencetag)测序EST是一种重要的基因组图分子标记,以EST为探针很容易从cDNA文库中筛选全基因,又可从BAC克隆中找到其基因组的基因序列.优点:AmRNA可直接反转录成cDNA,而且cDNA文库也比较容易构建;B对cDNA文库大量测序,即可获得大量EST的序列;CEST为基因的编码区,不包括内含子和基因间区域,一次测序的结果足以鉴定所代表的基因;5.人类基因组计划人类基因组计划（Humangenomeproject）于1990年启动，我国于1999年加入该计划，承担其中1%的任务，即人类3号染色体短臂上约30Mb的测序任务。5.1人类基因组计划的目的STEP4STEP3STEP2STEP1阐明人类基因组30亿个碱基对的序列，发现所有人类基因，并搞清其在染色体上的位置;破译人类全部遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面地