淀粉酶固定化实验方案.doc

实验三、α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测 一、实验背景： 酶：生物体内活细胞产生的具有催化作用的有机物。 在21世纪，酶已经大规模地应用于食品、化工、轻纺、医药等各个领域： ·果汁制作（果胶酶分解细胞壁，促进果汁生成。） ·加酶洗衣粉（某些酶对污渍的作用一般碱性物质更大） ·根据体内酶活性变化检测疾病（淀粉酶的活性大小可体现胰脏、肾脏的功能） 固定化酶：将水溶性酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。 直接使用酶缺点 固定化酶优点 通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活 固定化酶提高了酶的稳定性，可较长时间地储存和使用；（更能耐受温度、PH的变化） 溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本 固定化酶可以被反复使用，更经济，更利于生产 反应后会混在产物中，可能影响产品质量(难分离） 酶既能与反应物接触，又能与产物分离纯化 固定化酶载体应具备以下要求大体上有： 1) 在酶催化反应过程的惰性：载体应不与底物、产物及介质发生反应。 2) 有良好的渗透性：制备成柱子后，能使底物和产物能快速通过减少吸附。 3) 有生物亲和性和相容性，有利于酶活力发挥和稳定。 4) 有较高酶负载量，载体表面能提供多个活性位点利于酶分子偶联。 二、实验原理： 一般酶的固定化方法：吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。 1、一般酶固定化的传统：吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。 吸附法 利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有HYPERLINK /view/537178.htm物理吸附法和HYPERLINK /view/2913717.htm离子吸附法。 常用吸附剂有HYPERLINK /view/145596.htm活性炭、HYPERLINK /view/157830.htm氧化铝、HYPERLINK /view/106352.htm硅藻土、HYPERLINK /view/1572523.htm多孔陶瓷、HYPERLINK /view/1302031.htm多孔玻璃等。 采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。 包埋法 包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，酶生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解帤基青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。 结合法 酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂，反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶。 交联法 依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、HYPERLINK /view/15665.htm顺丁烯二酸酐等。HYPERLINK /view/1663234.htm酶蛋白的游离HYPERLINK /view/46569.htm氨基、酚基、HYPERLINK /view/1849694.htm咪唑基及巯基均可参与HYPERLINK /view/2169951.htm交联反应。 交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，使酶分子和多功能试剂之间形成共价键，得到三向的交联网架结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在着一定的分子内交联。多功能试剂制备固定化酶方法可分为：( 1) 单独与酶作用；( 2) 酶吸附在载体表面上再经受交联；( 3) 多功能团试剂与载体反应得到有功能团的载体，再连接酶。交联剂的种类很多，最常用的是戊二醛，其他的还有异氰酸衍生物、双偶氮二联苯胺、N，N-乙烯马来酰亚胺等。交联法的优点是酶与载体结合牢固，稳定性较高；缺点是有的方法固定化操作较复杂，进行化学修饰时易造成酶失活。 各类固定化方法的特点比较: 比较项目 吸附法 结合法 交联法 包埋法 物理化学方法分类 物理吸附 化学共价键结合 物理离子键结合 化学键连接 物理包埋 制备难易 易 难 易 较难 较难 固定化程度 弱 强 中等 强 强 活力回收率 较高 低 高 中等 高 载体再生 可能 不可能 可能 不可能 不可能 费用 低 高 低 中等 低 底物专一性 不变 可变 不变 可变 不变 适用性 酶源多 较广 广泛 较广 小分子底物、