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猫病毒性鼻气管炎PCR检测方法的建立与应用

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猫病毒性鼻气管炎PCR检测方法的建立与应用

摘要：本文针对猫病毒性鼻气管炎（FHV-1）的快速诊断，建立了基于PCR技术的检测方法。首先，通过文献调研和基因序列分析，设计并合成了针对FHV-1基因组的特异性引物和探针。然后，在优化PCR反应条件的基础上，对建立的PCR检测方法进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果表明，该方法对FHV-1的检测敏感性达到100%，特异性达到99%，重复性良好。最后，将该方法应用于实际临床样本的检测，取得了良好的效果。本研究建立的PCR检测方法为FHV-1的快速诊断提供了可靠的技术手段，对兽医临床具有重要的应用价值。

猫病毒性鼻气管炎（FHV-1）是一种高度传染性的病毒性疾病，主要感染猫科动物，临床表现为鼻炎、结膜炎、呼吸道症状等。该病对猫咪的健康和福利造成了严重威胁，同时也给宠物主人带来了巨大的经济损失。因此，快速、准确的诊断方法对于控制该病的传播具有重要意义。目前，FHV-1的诊断主要依赖于病毒分离、免疫学检测和分子生物学检测等方法。然而，病毒分离过程复杂，免疫学检测受抗体水平影响较大，而分子生物学检测具有快速、灵敏、特异等优点，成为兽医临床诊断的重要手段。本研究旨在建立一种基于PCR技术的FHV-1检测方法，以提高诊断效率和准确性。

一、1.材料与方法

1.1实验材料

(1)实验材料主要包括FHV-1阳性对照菌株、阴性对照菌株、临床疑似病例样本以及阴性样本。其中，FHV-1阳性对照菌株为本实验室保存的典型毒株，经PCR检测确认阳性；阴性对照菌株为已知无FHV-1感染的猫科动物菌株；临床疑似病例样本来源于兽医临床收集的疑似感染猫的鼻腔拭子、眼分泌物等；阴性样本则包括健康猫的鼻腔拭子、眼分泌物等。这些材料均经过严格的质量控制，确保实验结果的准确性。

(2)实验过程中使用的试剂主要包括PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、DNA分子量标准、DNA连接酶、Taq聚合酶、dNTPs、缓冲液等。PCR试剂盒包括引物、探针、PCR反应缓冲液等，引物和探针均通过生物信息学软件设计并合成，确保针对FHV-1基因组的特异性；DNA提取试剂盒用于提取临床样本中的病毒DNA，提取效率高，纯度高；DNA分子量标准用于PCR产物大小的定量分析；DNA连接酶和Taq聚合酶用于PCR反应，确保PCR反应的顺利进行；dNTPs和缓冲液则提供PCR反应所需的原料和条件。

(3)实验设备包括PCR仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、离心机、振荡器、移液器等。PCR仪用于进行PCR扩增，具有快速、高效、准确等优点；紫外分光光度计用于检测DNA的浓度和纯度；凝胶成像系统用于观察PCR产物的电泳结果，便于后续数据分析；离心机用于分离混合物中的不同组分，如DNA提取过程中的细胞膜和细胞核分离；振荡器用于混合溶液，确保反应充分；移液器用于精确量取试剂，保证实验的精确性。所有设备均经过校准和验证，确保实验结果的可靠性。

1.2引物和探针的设计与合成

(1)在引物和探针的设计过程中，首先对FHV-1的基因序列进行了全面分析，选取了病毒基因组中具有高度保守性的区域作为靶标。通过生物信息学软件，如PrimerPremier5.0和Oligo6.0，设计了两对引物和一对探针。引物长度分别为20和18个碱基，探针长度为60个碱基。设计过程中，确保了引物和探针的Tm值在58-62℃之间，以优化PCR反应条件。此外，对引物和探针的特异性进行了分析，通过BLAST比对，未发现与任何其他已知病毒基因存在同源性，保证了检测的特异性。

(2)在引物和探针合成后，对其进行了序列测定，确保合成质量。实验结果表明，合成的引物和探针序列与设计序列完全一致，未发生突变。随后，将合成的引物和探针应用于PCR扩增实验。选取了FHV-1阳性对照菌株作为模板，进行了PCR扩增。在优化PCR反应条件后，得到了特异性强的扩增产物。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，扩增片段长度与预期目标一致，为250bp左右。进一步，将扩增产物进行测序验证，结果显示，扩增产物与FHV-1基因组的序列高度一致，证实了引物和探针设计的合理性。

(3)为了进一步验证引物和探针的适用性，将合成的引物和探针应用于实际临床样本的检测。选取了10份疑似感染FHV-1的猫的临床样本，包括鼻腔拭子和眼分泌物。将样本进行DNA提取，然后利用合成的引物和探针进行PCR扩增。在优化PCR反应条件后，所有疑似感染样本均呈现出特异性扩增带，而阴性对照样本无扩增带产生。此外，对扩增产物进行