3例瓜氨酸血症Ⅰ型患儿致病基因突变的筛查及其发病的分子机制研究.pdf

3例瓜氨酸血症I型患儿致病基因突变筛查及其分子发病机制的研究

摘要

目的：

本研究拟对来自山东地区的3个瓜氨酸血症I型（CTLNI）小家系进行致病

基因突变筛查，明确导致该家系CTLNI发生的致病基因及其突变位点。并以此

构建体外细胞真核表达载体，在蛋白水平和细胞水平探讨ASS1基因突变导致

CTLNI的分子发病机制。

方法：

（1）收集自2019年1月至2023年2月来自山东地区经新生儿筛查高度怀

疑为CTLNI的患儿干血斑标本，并提取其基因组DNA。利用目标区域外显子捕

获测序技术（Targetedexomesequencing，TES）及Sanger测序技术对患儿基因组

进行突变筛查以确定可能的致病基因突变。

（2）采集正常人群以及患儿家系中表型正常的患儿父母的EDTA外周血样本，

并提取其基因组DNA。利用Sanger测序技术对患儿父母基因组DNA进行突变

验证以明确患儿突变的父母来源，同时进行遗传的共分离分析。

（3）利用MutationTaster、M-CAP、REVEL、ClinPred、GERP及SWISS

MODEL等生物信息学软件对筛选出的可疑致病基因突变进行致病性预测、疏水性

评价和蛋白同源建模等分析，进一步探讨该基因突变的致病性。

（4）构建ASS1基因的野生型真核表达载体及突变型真核表达载体，并利用

阳离子脂质体转染技术将构建成功的真核表达载体瞬时转染至人肝癌细胞

（MHCC-97H）和人肾癌细胞（Caki-2）两种细胞系中，并获得ASS1基因稳定表

达的转染细胞系。

（5）通过实时荧光定量PCR技术（qPCR）及蛋白质免疫印迹（WesternBlotting，

WB）实验检测ASS1基因突变对ASS1-mRNA转录水平及翻译ASS1蛋白水

平的影响。

（6）通过细胞增殖实验（CCK-8）、划痕实验、Transwell侵袭实验以及ASS1

蛋白亚细胞定位实验来分别探究ASS1基因突变对MHCC-97H和Caki-2两种

细胞增殖能力、迁移能力、侵袭能力以及ASS1蛋白亚细胞定位的影响。

结果：

（1）采用TES技术及Sanger测序技术对经新生儿筛查高度怀疑为CTLNI

的患儿基因组DNA进行致病基因的筛查及验证，结果在这3名患儿基因组

DNA中检测到ASS1基因上6个不同的突变类型，它们分别是：

患儿1：ASS1-c.952GT(p.A318S)和ASS1-c.953CT(p.A318V)杂合突变；

患儿2：ASS1-c.256CT(p.R86C)和ASS1-c.577GA(p.G193R)杂合突变；

患儿3：ASS1-c.1142GA(p.G381D)和ASS1-c.970+5GA杂合突变。

（2）经过REVEL、MutationTaster、M-CAP、GERP、ClinPred这些生物信息

学软件的预测，6个ASS1基因突变中的5个错义突变所导致氨基酸改变的位点

均位于ASS1蛋白高度保守区域，因而该ASS1基因错义突变均被定义为致病性

突变，而ASS1-c.970+5GA为内含子突变其致病性缺乏明显依据。同时，利用

SWISS–MODEL软件对5个ASS1基因错义突变产生的氨基酸