EGFR荧光原位杂交与免疫组化检测的比较分析解析.ppt
EGFR荧光原位杂交与免疫组化检测的比较分析
广州医科大学附属第一医院病理科
林毅妍
序言
近年来,以表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)为治疗靶标的分子靶向治疗在非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)治疗中越显突出。EGFR基因的检测不仅可认为分子靶向药物的使用提供有效指导,也可认为肺癌治疗措施的制定以及肺癌预后的鉴定提供重要信息。目前临床病理工作中,对EGFR基因扩增的检测使用较多的措施有荧光免疫原位杂交(FISH)技术、免疫组化(IHC)检测技术、PCR扩增检测技术等。本文将对荧光原位杂交与免疫组化两种检测进行比较分析。
材料
标本来源:广州医科大学第一附属医院1月~1月行支纤镜及手术切除的NSCLC病例,其中男性21例,女性19例;年龄30~85岁,中位年龄58岁。所有标本均经10%中性缓冲福尔马林液固定,常规石蜡包埋。40例标本行持续切片,同步行FISH检测与免疫组化检测。
重要试剂与仪器
蛋白酶K,探针:GLPEGFR/CSP7探针(北京金菩嘉企业),胃蛋白酶消化液,人抗EGFR单克隆抗体(即用型)购于福州迈新生物企业。Dako杂交仪、观测用OlympusBX51型显微镜和NikonH600L荧光显微镜。
检测措施
(1)FISH检测:
3μm组织切片TO脱蜡至水
煮沸去离子水处理15min
室温下2×SSC中漂洗2次,每次5min
在组织上滴加蛋白酶K工作液,在37℃预热的孵育盒中消化3~5min
室温下用2×SSC溶液中洗涤2次,每次5min,乙醇梯度脱水,自然干燥
避光环境中,探针混合液滴于玻片杂交区域
在温度80℃的自动杂交仪中变性5min,42℃杂交16小时
第二天46℃水浴箱中2×SSC10min,0.1%NP40溶液洗涤5min,室温70%乙醇3min
暗处自然干燥玻片后加DAPI复染液,放于暗盒中复染5min
OlympusBX51型荧光显微镜在DAPI/FIFC/RHOD三色滤光镜激发下观测间期细胞荧光杂交信号
检测措施
(2)IHC检测:
3μm组织涂胶片,57℃烤片过夜,浸于二甲苯中脱蜡至水
在组织上滴加胃蛋白酶消化液,在37℃预热的孵育盒中消化30min
采用EnVision二步法,严格按照阐明书操作
成果判断
(1)FISH成果鉴定:红色信号代表检测的靶基因,绿色信号代表靶基因所在的染色体着丝粒。检测EGFR基因计数100个细胞,记录Ratio值(100个细胞核中红色信号数/100个细胞核中绿色信号数)。
FISH阳性分为:EGFR基因扩增:
①Ratio≥2为阳性成果;
②≥15个红色信号的细胞数占细胞总数的10%以上;
③出现成团红色信号的细胞;高多体性:Ratio<2,但≥4个红色信号的细胞数占细胞总数的40%以上。
FISH阴性:Ratio<2为无扩增。
成果判断
(2)IHC成果鉴定:染色成果根据细胞膜着色的阳性细胞百分率和阳性染色程度评价。
着色细胞占计数细胞百分率≤5%为0分;6~25%阳性细胞为1分;26~50%阳性细胞为2分;>50%阳性细胞为3分。
再结合染色强度,无色为0分,浅黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分。将每张切片着色细胞百分率得分与着色程度得分相乘,为其最终得分。
同一视野如有染色强度不一,取其平均值作最终得分。
0~1分为阴性(-),2~3分为弱阳性(1+),
4~6分为中等阳性(2+),6分以上为强阳性(3+)。
记录学处理
采用SPSS17.0记录软件进行描述性分析。
FISH技术与IHC法检测成果的比较使用x2检查。
成果FISH
图1.EGFRFISH(+)
(高多体)
图2.EGFRFISH(+)(点簇状)
图3.EGFRFISH(-)
成果IHC
+++
++
+
-
成果
FISH技术与IHC法检测EGFR的成果比较见表1。
FISH
IHC
合计
(-)
(1+)
(2+)
(3+)
(+)
6
5
2
2
15
(-)
19
5
1
0
25
合计
20
10
3
2
40
表1FISH技术与IHC法检测EGFR的成果比较
40例NSCLC标本中,FISH显示为阳性的15例,其中IHC检测EGFR体现为(—)的6例(40%),阳性的9例(60%);FISH显示为阴性的25例,其中IHC检测EGFR体现为(—)的19例(76%),阳性的6例(24%)。
IHC检测阳性例数高于FISH检测阳性例数,差异无记录学意义(x2=5.184,P>0.05)。
讨论
表皮生长因子受体(EGFR)是一种蛋白酪氨酸激酶受体,