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小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备2009/06/29 汪丽丽 共3页 目的 培养MEF细胞做饲养层细胞，为胚胎干细胞的扩增提供环境条件。 主要超净工作台上海力新实业有限，HFSsfe-1200 CO2细胞培养箱SANYO，MCO-15AC - 80℃超低温冰箱REVCO，LEGACI 倒置相差显微镜Olympus，U-PMTUC 数码照相机Olympus，C-3040ZOOM 台式高速离心机 Eppendorf，ispin 液氮罐CBS 各种规格培养板、培养皿Falcon 细胞培养主要试剂 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养液 DMEM/h（HycloneSH30022.01） 85%； FBS（?Hyclone30071.03?） 15% 丝裂霉素C（Sigma, M4287） 饲养层培养液溶解μg/ml，分装，-20℃保存。Gelatin Sigma, G2500 超纯水溶解，1g/L。高压灭菌后，4℃保存。 0.5％trypsin＋EDTA Hyclone, SH30042.01 小鼠胚胎成纤维细胞冻存液 小鼠胚胎成纤维细胞培养液 90%； DMSO Sigma, D5879 10%；实验步骤 1 小鼠MEF的制备. 取材：⑴ 准备100mm培养皿一个，60mm培养皿两个，小滴管向三个培养皿中均加入PBS，小皿PBS量约4~5滴管，要求皿中PBS能浸泡之后所容组织即可。 ⑵ 脱颈处死孕1.5~13.5天的雌鼠①捉小鼠尾巴，将小鼠取出笼子。②左手揪住尾巴，右手握住剪子用剪子上部按住颈部。③两手向两边用力拉伸，同时右手下压颈部。④腹部朝上喷洒酒精消毒。 ⑶ 镊子提起腹部下方的皮肤，剪开小口，向上撕开，镊子提起腹膜剪开腹腔，可见子宫中深红色胚胎连成串，从右侧剪下子宫韧带，连同子宫一起取下，放入装有PBS的100mm培养皿中。 ⑷ 用眼科剪沿子宫纵轴剪开，胎盘、羊膜等胚胎外组织，PBS的60mm培养皿中。 ⑸ 记下胚胎数量，两个直头镊子去除胚胎头、内脏及四肢。. 清洗：将胚胎剩余部分移入. 消化： ⑴ 将胚胎织移入1ml离心管内，加5ml胰蛋白酶溶液37℃温育15分钟。⑵ 使消化液自行沉降，如仍有残渣，吸取上层溶液到灭菌容器，用两倍体积血清培养基中和胰酶活性，终止消化。剩余残渣重复此消化过程，最终所有组织基本消化完全，溶液收集到一起。 5. 培养和传代：⑴ 用饲养层细胞培养液⑵ 约2~3天后传代，90%汇合时1：3传代5代以内的细胞用作饲养层。. 冻存和复苏： 细胞冻存：①大皿长满，一皿冻两管。②PBS洗次，加入胰酶，37℃ 5分钟，加入含血清的培养液终止消化，低速离心洗涤，收集细胞③加入冻存液，移入冻存管内，置于冻存盒内，-80℃冰箱过夜，次日投入液氮。 细胞复苏：①一冻存管复苏1个100mm培养皿，加入ml饲养层细胞培养液一离心管。②取出冻存管立即投入37℃水浴，反复摇至液体全部解冻，将细胞悬液移入离心管内，离心弃上清，加培养液重悬细胞，培养皿内，放入培养箱培养。③复苏细胞长满后用丝裂霉素C处理，传代到明胶培养皿中作饲养层细胞使用。 2. 丝裂霉素C处理MEF细胞加入丝裂霉素C（10μg/ml）工作液孵育2小时后吸出，用PBS充分洗涤，将01%明胶溶液均匀铺满培养皿，室温静置吸出明胶溶液将MEF细胞铺在明胶包被的培养皿上，饲养层细胞培养液继续培养备用。 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备 北京大学工学院葛子钢实验室 1