第二章-沉淀法.ppt

第二章 沉淀法; 沉淀法（溶解度法）—是纯化生物大分子物质常用的一种经典方法优点：操作简单，成本低廉分类：盐析沉淀 有机溶剂沉淀 选择性沉淀;第一节 基本原理;;;;一般操作步骤（蛋白质分级沉淀时常用）;1. 盐的分级沉淀 ; b. 分级效果好，有些抽提液经过加入适量硫酸铵的一次性可除杂蛋白75%以上 c. 有稳定蛋白质结构的作用，将2-3mol/L硫酸铵盐析的蛋白质置低温下保存一年，其性质没有变化 d. 价格低廉，废液可肥田缺点：即得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐;（2）硫酸铵盐析的操作;② 饱和溶液加入法;优点：比加入固体硫酸铵沉淀法温和。 缺点：对于大体积样品不适用。因为硫酸铵溶液的大量加入，将导致样品溶液体积增加。;③ 透析盐析法;2．盐析曲线的制作;如此连续进行，便可得到6-10个分级沉淀部分。然后将每个分级沉淀部分分别重新溶解于一定体积的适宜pH的缓冲液中，根据其蛋白质或酶含量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系作图，即可得到典型盐析曲线。 在此曲线基础上，参照分级试验方法，可找出有利于提高收得率和纯化倍数的精细盐析范围。;3. 盐析的影响因子; Ka值大，则意味着有效成分溶解度降低的速率快。 因此，对一种有效成分而言，Ka值越大，分级范围越窄。盐析效果就越好。 某一蛋白质的Ka值： 与蛋白质本身的性质有关 与溶液的pH、温度和盐的种类等有关;(2)盐的分级范围的差异性 ;(3) pH和盐浓度;(4) 蛋白质的纯度和浓度;(5) 其它;4．脱盐 ;透析时注意：;（2） 选用适当的透析液 一般选用：低离子强度的中性缓冲液对含有辅基的酶透析时，在透析液中宜加入适量的辅基或保护辅基的试剂。为了防止微生物生长，透析应在4℃进行或在透析液中添加0.02％叠氮化钠。;(3) 掌握透析时间 搅拌下进行，样品液与透析液体积之比以1:10较好，一般三小时。 在静止状态下过夜进行时，则比例应扩大到1:20以上。;盐脱是否彻底，要经常检查： 除去硫酸铵，可用10%氯化钡检查 除去氯化钠，可用10％硝酸银检查 ???析液中检测不出现硫酸钡或氯化银沉淀，即透析完成。;二、有机溶剂沉淀法;;;需要指出：;（2）中性盐的作用;（3）多价阳离子的作用;三、 蛋白质沉淀剂;2．凝集素;3．重金属;四、聚乙二醇沉淀作用;五、选择性沉淀法;原理：等电点、热变性、酸碱变性和特殊的可逆沉淀作用 优点：选择性较强，方法简单，种类较多 缺点：应用范围较窄 应用范围：各种生物大分子物质的沉淀;六、 结晶;对难结晶的物质，有时采用加入少量“晶种”引子，或进行适当搅拌，或在容器壁上用玻棒轻轻摩擦等办法，对结晶形成有加速作用。