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高效液相色谱法测定植物油中黄曲霉毒素B1含量的不确定度评定

一、1.测量方法概述

(1)高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分析技术，在测定植物油中黄曲霉毒素B1（AFB1）含量方面具有高效、灵敏、准确等优点。该方法的基本原理是利用AFB1在特定溶剂中的溶解度与植物油中其他成分的差异，通过液-液萃取或固相萃取等前处理技术将AFB1从植物油中提取出来，然后通过高效液相色谱仪对提取的样品进行分析。HPLC系统由液相色谱仪、自动进样器、检测器等部分组成，其中液相色谱仪通过高压泵将流动相输送至色谱柱，样品在色谱柱中经历不同组分间的相互作用，实现分离。

(2)在实际操作中，高效液相色谱法测定植物油中AFB1含量的具体步骤包括样品前处理、液相色谱条件优化、数据分析等。样品前处理是关键步骤，主要包括溶剂的选择、萃取方法、净化方法等。通常，采用乙腈或甲醇作为溶剂进行液-液萃取，以提取植物油中的AFB1。萃取后，样品需经过净化步骤，如使用C18小柱或氧化铝柱等，以去除杂质，提高检测的准确性。液相色谱条件优化包括选择合适的色谱柱、流动相组成、流速等，以确保AFB1能够得到有效分离。

(3)检测过程中，AFB1的定量通常采用荧光检测器，通过测定其荧光强度来定量。在数据分析阶段，需要对液相色谱图进行解析，确定AFB1的保留时间和峰面积，并与标准曲线进行比对，计算样品中AFB1的含量。此外，为了确保测定结果的可靠性，还需进行空白实验、加标回收实验和重复性实验等，以评估方法的准确度和精密度。高效液相色谱法测定植物油中AFB1含量的整个流程需要严格控制，以确保结果的准确性和可靠性。

二、2.不确定度来源分析

(1)测量不确定度是评估分析方法准确性和可靠性的重要指标。在高效液相色谱法测定植物油中黄曲霉毒素B1含量的过程中，不确定度主要来源于以下几个方面。首先，样品前处理过程中可能引入的不确定度，如溶剂的准确度、萃取效率、净化效果等。以溶剂为例，如果乙腈的浓度误差为0.5%，在萃取过程中可能导致AFB1的回收率误差达到5%。

(2)其次，液相色谱条件的不确定度也是影响测定结果的重要因素。例如，色谱柱的选择、流动相的组成、流速等参数的变化都会对AFB1的分离效果产生影响。以色谱柱为例，假设不同品牌的色谱柱对AFB1的保留时间差异为1.5%，这将导致AFB1的定量结果存在3%的不确定度。此外，检测器的不确定度也不容忽视，如荧光检测器在检测AFB1时，其灵敏度误差为2%，可能引入2%的不确定度。

(3)最后，实验操作者的主观因素也会引入不确定度。例如，操作者在进样、调谐等过程中的操作误差可能导致AFB1的定量结果出现波动。据相关研究表明，操作者的主观误差可能导致AFB1的测定结果存在5%的不确定度。在实际案例分析中，某实验室在测定同一批次植物油中AFB1含量时，由于操作者未按照规范进行进样，导致测定结果误差达到7%，远高于预期的不确定度范围。因此，提高操作者的技能和规范操作流程是降低不确定度的重要措施。

三、3.不确定度计算

(1)在进行高效液相色谱法测定植物油中黄曲霉毒素B1含量的不确定度计算时，首先需要识别和量化各个不确定度来源。以某实验室的测定结果为例，假设该实验室使用的是高效液相色谱法，通过液-液萃取和C18小柱净化，采用荧光检测器对AFB1进行定量。在此过程中，不确定度来源包括样品前处理、仪器设备、实验操作、环境因素等。

具体计算步骤如下：首先，对样品前处理过程中的不确定度进行评估。假设使用乙腈作为溶剂，乙腈的浓度误差为0.5%，而乙腈的用量为100mL，则由于溶剂浓度引起的不确定度为0.5%×100mL=0.5%。其次，评估萃取效率的不确定度。假设萃取效率为95%，则萃取效率的不确定度为（100%-95%）/95%=5.26%。将这两项不确定度合并，得到样品前处理的不确定度为√(0.5%^2+5.26%^2)≈5.27%。

(2)接下来，考虑仪器设备的不确定度。假设使用的色谱柱对AFB1的保留时间差异为1.5%，这意味着AFB1的定量结果存在3%的不确定度。此外，荧光检测器的灵敏度误差为2%，可能引入2%的不确定度。对于色谱仪的流速，假设标准流速为1.0mL/min，实际流速波动为±0.1mL/min，则流速的不确定度为0.1mL/min/1.0mL/min=10%。将这三项不确定度合并，得到仪器设备的不确定度为√(3%^2+2%^2+10%^2)≈11.18%。

(3)最后，评估实验操作者的不确定度。假设操作者在进样、调谐等过程中的操作误差可能导致AFB1的测定结果存在5%的不确定度。此外，环境因素如温度、湿度等的变化也可能引入不确定度。假设温度波动为±0.5℃，湿度波动为±5%，则温度和湿度的不确定度分别为