分子生物学 第3章DNA体外重组.pptx

DNA体外重组;;第一节

基本流程和必备工具;分－－;重组DNA技术的基本过程（1）;重组DNA技术的基本过程（2）;(一)限制性核酸内切酶;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；

第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；

第四个字母代表株；

用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅰ和Ⅲ型限制酶通常是相对分子量较大的多亚基蛋白质复合物，同时具有内切酶和甲基化酶活性，反应过程中需有Mg2+和ATP参与。;Ⅱ类酶识别序具有回文结构(palindrome)特点，即具有双重旋转对称结构的两条DNA链的碱基序列的反向重复。;;;;;2.酶切效率;影响酶切效率的因素：;影响酶切效率的因素：;影响酶切效率的因素：;限制性内切酶酶切中常见的问题和原因;能使在DNA双链上相邻的5?-磷酸基和3?-羟基之间形成3?,5?-磷酸二酯键从而封闭DNA链上的缺口或连接2个DNA片段。;连接黏性末端作用模式图：;连接平末端作用模式图：;(三)DNA聚合酶;3.TaqDNA聚合酶;1.末端脱氧核苷酸转移酶

（terminaldeoxynucleotidyltransferase）;(2)底物是3’平端或3’凹端的双链DNA。;2.碱性磷酸酶

（alkalinephosphatase）;载体（vector）的概念;(一)质粒(plasmid)载体;;ampr;阳性克隆;(2)质粒pUC18/19:pBR322衍生的克隆载体;pUC质粒载体插入了β半乳糖苷酶N端α肽片段的编码基因lacZ’；表达的产物α肽也无酶活性，也不能分解培养基中的X-gal。;α;蓝色菌落：阴性克隆;白色菌落：阳性克隆;(3)TA克隆载体;是在克隆载体的基础上，在多克隆位点的上下游加上特殊启动子序列，从而使其既可作为克隆载体又可在体外将插入的DNA片段转录成mRNA的双重功能载体。如pGEM-3Z/4Z。;;是在克隆载体的基础上，加上可使插入基因在宿主细胞中表达所需的必要元件，如启动子、终止子、核糖体识别位点、起始密码和终止密码等。;;;;(二)病毒载体(viralvector);;(1)pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒表达质粒;(2)病毒包装辅助质粒pHelper1.0;(3)病毒包装辅助质粒pHelper2.0;(三)人工染色体载体;第二节

DNA重组前的准备工作;;2.载体上可操作的酶切位点;;;;;第一节基本流程和必备工具;第三节

目的DNA片段的获取及准备;;反转录;gDNA文库：g-文库;Screeningagenomiclibrarybycolonyhybridization.;化学合成：德国KA公司的DNA合成仪,可合长200bp。;;;;第四节

DNA片段与载体的重组;;EcoRⅠ切割位点;;;EcoRⅠ;PCR扩增;1.连接反应的温度和时间;第五节

重组DNA的克隆化及鉴定;1.转化(transformation)

将质粒DNA或以质粒载体构建的重组DNA导入原核细胞细菌(大肠埃希菌)的过程。;(一)大肠埃希菌作为宿主细胞;;;;(一)重组DNA的克隆筛选;(二)重组质粒的提取鉴定;;DNA体外重组的主要技术操作;外源基因表达涉及目的基因的克隆、复制、转录、翻译、蛋白质产物的加工及分离纯化等过程，需要在适合的表达系统中完成。;;;;;;;;;----最常用的是大肠杆菌（E.coli）表达体系统;产品;②不宜用于表达真核基因组DNA，只适于表达cDNA；;;;;;;;;;;;优点：;;;（1）真核表达载体大多是穿梭载体;（3）外源基因在真核细胞中有两种表达方式;112;