WATERS液相色谱教程三四七(最全).pptx
Waters中国有限公司培训中心;开启HPLC系统各个设备的电源
打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自检后，打开计算机，启动色谱管理软件
准备流动相
过滤,脱气
色谱泵排气
用新配制的流动相灌注泵;用准备好的流动相平衡色谱系统
可在泵的控制面板上设定流速参数(15×5泵需在软件控制下操作)
系统大约需平衡0.5--1小时方能稳定工作
准备样品
用流动相溶样或重组样品
编制仪器方法,开始实验;色谱柱对流动相的要求
过滤除去微粒
纯度的要求
超纯水，或用KMnO4处理过的双蒸水
有机溶剂：色谱纯(溶剂中的杂质含量尽可能低)，
并与填料相匹配
缓冲液的pH值，在填料的允许范围(一般在pH2-8)内
缓冲液（盐）的浓度不要太高(≤100mM)
流动相对样品的溶解度
调整有机溶剂和水的比例
最好用流动相溶样;液相色谱仪器对流动相的要求∶
与检测器匹配
脱气
避免用含卤素离子的缓冲盐（不锈钢系统）
溶剂的粘度
防止细菌的生长;流动相脱气的目的
使色谱泵的输液准确
输液量均匀准确，并且脉动减小
保留时间及色谱峰面积的重现性提高
提高检测的性能
防止气泡引起的尖峰
基线稳定，信噪比增加
溶剂的紫外吸收本底降低
保护色谱柱
减少死体积
防止填料的氧化;加热
简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化
抽真空
同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果
超声波振荡
简单，但效果不够理想；超声时间不要太长(1分钟左右即可)
通惰性气体（一般用氦气）
可保持在线连续脱气，多用于低压梯度
在线脱气机（in-linedegasser)
可保持连续脱气，多用于低压梯度;有机溶剂流动相:
室温下密封,避光保存
缓冲盐流动相:
当日现配现用
低温下密封保存,一般不超过3天
防止微生物生长
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:
低温密封保存
防止有机相的挥发
选用适宜的容器;;;色谱泵实验前，应先确认泵头内没有气体，如有气体要按以下步骤排气：
将泵入口管吸滤头放入脱过气的流动相中
打开泵及在线脱气机电源开关
将排液阀打开，或断开与色谱柱连接的管路
设置流速到6-9ml/min,排液阀出口有液流连续流出
必要时(600泵)用10ml注射器从泵入口注入流动相
对于600,2695四元梯度泵,分别对所用各路溶剂进行排气操作
停止泵流速,关闭排液阀,恢复断开的管路,备用
注:泵排气后,应输液稳定(系统压力脉动小,一般在几十
Psi以内),否则,需重做排气操作;电源开关
柱塞杆清洗孔
排液阀;Waters600泵的前面板;溶剂瓶盘;2695排气操作示意图;关于色谱系统的反压;反压与溶剂组成的关系;反压与流速的关系;反压与温度的关系;影响系统反压的其它因素;排气后的色谱泵即可用于实验运行
注意∶
排气后，先设流速为0
恢复排气时断开的部分，如:进样器、色谱柱
如需要，恢复排气时断开的控制线
根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值
若使用缓冲盐流动相,用前和用后均需用水过渡(包括排气操作)
;流动相要过滤
常用缓冲液时，停泵前要用水清洗泵头，并用水冲洗柱塞杆清洗孔
关闭排液阀时，不要太用力拧紧，以不渗液为准
更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如不互溶，要用一种中间溶剂过渡
色谱泵在停用时,应先用水洗去缓冲盐,然后用纯甲醇充满泵头及管路,并保存在纯甲醇中;色谱泵吸滤头,进出口阀及管路(包括进样器和检测池)若被污染,应作清洗和钝化处理
一般采用30％磷酸水溶液作为清洗剂，用6M硝酸作为钝化剂，先清洗再钝化
清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢
钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜
;清洗液用30%磷酸水溶液
30%磷酸配制:取85%浓磷酸35ml与65ml水混匀
清洗步骤如下:
取下色谱柱，用两通(Union)连接进样器和检测器
用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%)
用30%磷酸清洗液洗系统(1ml/min流速)45分钟
(四元泵的A,B,C,D四路各为25%)
换成清水洗至出口水pH显中性
用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用;钝化液用6M硝酸水溶液
6M硝酸的配制:取浓硝酸40ml与60ml水混匀
钝化步骤如下:
在清洗步骤完成后进行钝化处理
确认清洗用的磷酸已基本洗净
用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%)
用6M硝酸水溶液钝化系统(1ml/min流速)45分钟
换成清水洗至出口水pH显中性
用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用;标样和样品
标样:又称对照品,它作为液相色谱定性和定量分析的参
考标准物,一般是纯度较高的纯物质
样品:待测物,一般是成分复杂的混合物
液相色谱对样品(包括标样)制备的要求:
必须能溶于流动相