基因组学理论课 第三节 基因组分析策略和技术.ppt

3第一代DNA自动测序????????????????????????????????????????????????????????????????????????自动荧光毛细管凝胶电泳测序仪代表：安玛西亚公司MegaBACE100096个电泳读长高达500-600bp日分析能力达1000个样品自动荧光垂直板凝胶电泳测序仪代表：ABI公司377型垂直板自动测序仪96个泳道读长高达700-800bp日分析能力达300个样品????????????????????????????????????????????????????????????????????????电泳，看谁跑得快荧光检测探头短片段先检测到长片段后检测到4Solexa测序原理Solexa测序技术属于新一代测序技术（第二代），其核心思想是边合成边测序（sequencingbysynthesisorligation）。即生成新DNA互补链时，要么加入的dNTP通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的dNTP，在合成或连接生成互补链时，释放出荧光信号。通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。可以在DNA扩增表面读取数千万个32-40bp长的片段。GenomeAnalyzer????????????????????????????ClusterStation以边合成边测序为标志的新一代测序技术的代表有四种测序平台：Roche(454)GSFLXsequcncerIlluminagenomeanalyzer(Solexa)AppliedBiosystemsSOLiDsequencerHeliScopeSequencer?Solexa公司在2006年被Illumina公司以6.15亿美元的高价收购，并将Solexa测序仪命名为Illuminagenomeanalyzer。1)添加接头：

利用物理方法将待测样品DNA打碎，在单链DNA碎片两端加上接头5Solexa测序流程2).表面结合(ClusterStation)

Solexa测序时利用微注射系统将已经加过接头的待测片断和接头随机添加到玻璃FlowCell内，每一个FlowCell又被分成8条lane，每条Lane的内表面上能以共价键的形式随机固定单链接头序列和带接头的单链待测DNA片断。

3).桥型扩增循环获得多拷贝待测DNA片断在Flowcell内加入未被标记的dNTP和酶起始固相桥型扩增；所有单链桥型待测片段被扩增成双链桥片断，通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面；通过不断循环，将会在Flowcell的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片断。4).测序：加入DNA聚合酶和被荧光标记的dNTP和接头引物进行扩增，在每一个测序列簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从获得待测片段的序列信息。三大规模测序的策略1工作框架图与精细图工作框架图:目的：获得基因组的基本结构信息（如GC组成、重复序列）、基因的识别和功能分类、SNP的发现等测序量：4－5倍基因组大小的覆盖度序列覆盖率：90%以上，准确度不低于99%。精细图目的：对重要功能基因及调控序列进行精确的染色体定位，为基因的功能研究奠定基础测序量：8－10倍基因组大小的覆盖度序列覆盖率：99%以上，序列准确度不低于99.99％。2全基因组霰弹法与逐步克隆法全基因组霰弹法（WholeGenomeShot-gun)逐步克隆法（ClonebyClone）全基因组霰弹法霰弹法(Shot-gun)，亦称“鸟枪法”，用于全基因组随机测序方法：借助物理或化学手段，将整个基因组随机打断成一定大小的片段进行测序，再根据序列间的重叠关系进行计算机排序和组装，确定它们在基因组中的位置优点：速度快，简单，成本较低缺点：序列的拼接组装比较困难，在重复序列较多的区域难度更大