《real-time qPCR全攻略》.pdf

荧光定量PCR完全攻略 1、什么是定量PCR ？ 以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中 靶基因的拷贝数，称为定量PCR 。定量PCR 的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。 2、定量PCR定量的理论依据是什么？ 特定的待扩增基因片段起始含量越大，则指数扩增过程越短，当扩增速率趋于稳定后， 则无论原来样品中起始模板含量多少，最终扩增片段的含量通常是一样的。 理想的扩增结 果：Y=X×2n 其中Y代表扩增产物量， X代表PCR反应体中的原始模板数 n为扩增次数； 理 论上PCR扩增效率为 100%，PCR产物随着循环的进行成指数增长，但实际上：DNA 的每一 次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈 2 的倍增长；实际应为：Y= X(1+E)n ，其 中E 代表扩增效率：E = 参与复制的模板/总模板，通常E≤1，E在整个PCR扩增过程中不是 固定不变的。通常X 在 1～105 拷贝、循环次数n≤30 时，E 相对稳定，原始模板以相对固 定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；随着循环次数n 的增加（30 次），E值逐渐减少，Y 呈非固定的指数形式增加，最后进入平台期。 3 、荧光定量PCR定量的理论模式又是什么？ PCR 是对原始待测模板核酸的一个扩增过程，任何干扰 PCR 指数扩增的因素都会影响扩 增产物的量，使得 PCR 扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通 过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。近年来研究人员通过大量的实践，研究了 相对准确的定量 PCR 方法，即荧光定量 PCR。 n PCR扩增通式： ① T =T （1+E） n 0 n ② T =Tn- （1+E） 注：[0E 1] n 1 其中E表示扩增效率，n为循环数，T 表示在n个周期后PCR产物的数量，Tn- 表示在n-1 个周 n 1 期后PCR产物的数量，T0为原始模板数量。设定PCR到达指数扩增期时，产生一定的荧光(荧 光依赖于某一循环扩增产物的总量，即特定的拷贝数K ，为常数，大约在 1010左右)高于背 CP 景为仪器所识别，此时的循环数为CP （crossing point ）,也就是K= T0 （1+E） ，取对数即： lg K=lg T0+CP*lg(1+E) CP=- 1/lg(1+E)*lg T0 +lgk/lg(1+E) 由于对一特定的PCR而言，E与K均为常数，故上式为循环数（CP ）对原始模板拷贝数的对 1 热线电话：021 －5446 0831 8009881995 E-mail:master@ 网址： 数（lg T ）一次方程，其标准形式y=kx+b,该直线的斜率为- 1/lg(1+E)，在横坐标上的截距为 0 lgk/lg(1+E) ，也是荧光定量PCR所谓的标准曲线。例如下图为单管实时荧光定量RT-PCR的标 准曲线： 目前荧光定量PCR 均采用外标定量 外标法定量PCR扩增效率的计算，由于标准曲线的斜率(Slope) 为- 1/lg(1+E) ，可知 E=10-1/Slope-1 ,如从标准曲线中知道Slope=-3.337,则可推知扩增效率E=101/3。337-1=0.99,也有作 者将(1+E)直接视为扩增效率E ，则E=10-1/Slope ，求得的E值均在 1—2